304 Συγκολλημένος σπειροειδής σωλήνας/σωλήνας από ανοξείδωτο χάλυβα, ζημικό ζουμπόν, βιοσυνθετικό δυναμικό του παγκόσμιου θαλάσσιου μικροβιώματος

Σας ευχαριστούμε που επισκεφτήκατε το Nature.com.Χρησιμοποιείτε μια έκδοση προγράμματος περιήγησης με περιορισμένη υποστήριξη CSS.Για την καλύτερη εμπειρία, συνιστούμε να χρησιμοποιήσετε ένα ενημερωμένο πρόγραμμα περιήγησης (ή να απενεργοποιήσετε τη λειτουργία συμβατότητας στον Internet Explorer).Επιπλέον, για να διασφαλίσουμε τη συνεχή υποστήριξη, εμφανίζουμε τον ιστότοπο χωρίς στυλ και JavaScript.
Ρυθμιστικά που εμφανίζουν τρία άρθρα ανά διαφάνεια.Χρησιμοποιήστε τα κουμπιά πίσω και επόμενο για να μετακινηθείτε στις διαφάνειες ή τα κουμπιά του ελεγκτή ολίσθησης στο τέλος για να μετακινηθείτε σε κάθε διαφάνεια.

Αναλυτική περιγραφή προϊόντος

304 Συγκολλημένος σπειροειδής σωλήνας/σωλήνας από ανοξείδωτο χάλυβα
1. Προδιαγραφή: Σωλήνας/σωλήνας πηνίου από ανοξείδωτο χάλυβα
2. Τύπος: συγκολλημένος ή χωρίς ραφή
3. Πρότυπο: ASTM A269, ASTM A249
4. Σωλήνας πηνίου από ανοξείδωτο χάλυβα OD: 6 mm έως 25,4 mm
5. Μήκος: 600-3500MM ή σύμφωνα με την απαίτηση του πελάτη.
6. Πάχος τοιχώματος: 0,2mm έως 2,0mm.

7. Ανοχή: OD: +/-0,01mm;Πάχος: +/-0,01%.

8. Μέγεθος εσωτερικής οπής πηνίου: 500MM-1500MM (μπορεί να προσαρμοστεί σύμφωνα με τις απαιτήσεις του πελάτη)

9. Ύψος πηνίου: 200MM-400MM (μπορεί να ρυθμιστεί σύμφωνα με τις απαιτήσεις του πελάτη)

10. Επιφάνεια: Φωτεινή ή ανόπτηση
11. Υλικό: 304, 304L, 316L, 321, 301, 201, 202, 409, 430, 410, κράμα 625, 825, 2205, 2507, κ.λπ.
12. Συσκευασία: υφαντές σακούλες σε ξύλινη θήκη, ξύλινη παλέτα, ξύλινο άξονα ή σύμφωνα με την απαίτηση του πελάτη
13. Δοκιμή: χημικό συστατικό, αντοχή διαρροής, αντοχή εφελκυσμού, μέτρηση σκληρότητας
14. Εγγύηση: Η επιθεώρηση τρίτου μέρους (για παράδειγμα :SGS TV ) κ.λπ.
15. Εφαρμογή: Διακόσμηση, έπιπλα, μεταφορά λαδιού, εναλλάκτης θερμότητας, κατασκευή κιγκλιδωμάτων, χαρτοποιία, αυτοκίνητο, επεξεργασία τροφίμων, ιατρική κ.λπ.

Οι φυσικές μικροβιακές κοινότητες είναι φυλογενετικά και μεταβολικά διαφορετικές.Εκτός από τις υπομελετημένες ομάδες οργανισμών1, αυτή η ποικιλομορφία έχει επίσης πλούσιες δυνατότητες για την ανακάλυψη οικολογικά και βιοτεχνολογικά σημαντικών ενζύμων και βιοχημικών ενώσεων2,3.Ωστόσο, η μελέτη αυτής της ποικιλομορφίας για τον προσδιορισμό των γονιδιωματικών οδών που συνθέτουν τέτοιες ενώσεις και τις δεσμεύουν με τους αντίστοιχους ξενιστές τους παραμένει μια πρόκληση.Το βιοσυνθετικό δυναμικό των μικροοργανισμών στον ανοιχτό ωκεανό παραμένει σε μεγάλο βαθμό άγνωστο λόγω των περιορισμών στην ανάλυση δεδομένων ανάλυσης ολόκληρου του γονιδιώματος σε παγκόσμια κλίμακα.Εδώ, εξερευνούμε την ποικιλομορφία και την ποικιλομορφία των συστάδων βιοσυνθετικών γονιδίων στον ωκεανό ενσωματώνοντας περίπου 10.000 μικροβιακά γονιδιώματα από καλλιεργημένα κύτταρα και μεμονωμένα κύτταρα με περισσότερα από 25.000 πρόσφατα ανακατασκευασμένα βυθισμένα γονιδιώματα από περισσότερα από 1.000 δείγματα θαλασσινού νερού.Αυτές οι προσπάθειες έχουν εντοπίσει περίπου 40.000 υποτιθέμενες ως επί το πλείστον νέες συστάδες βιοσυνθετικών γονιδίων, μερικές από τις οποίες έχουν βρεθεί σε προηγουμένως ανύποπτες φυλογενετικές ομάδες.Σε αυτούς τους πληθυσμούς, εντοπίσαμε μια γενεαλογία εμπλουτισμένη σε συστάδες βιοσυνθετικών γονιδίων ("Candidatus Eudormicrobiaceae") που ανήκε σε μια ακαλλιέργητη βακτηριακή ομάδα και περιλάμβανε μερικούς από τους πιο βιοσυνθετικά διαφορετικούς μικροοργανισμούς σε αυτό το περιβάλλον.Από αυτές, έχουμε χαρακτηρίσει τις οδούς φωσφατάσης-πεπτιδίου και πυτοναμιδίου, εντοπίζοντας περιπτώσεις ασυνήθιστης δομής βιοδραστικών ενώσεων και ενζυμολογίας, αντίστοιχα.Συμπερασματικά, αυτή η μελέτη δείχνει πώς οι στρατηγικές που βασίζονται στο μικροβίωμα μπορούν να επιτρέψουν την εξερεύνηση ενζύμων και φυσικών τροφίμων που δεν είχαν περιγραφεί προηγουμένως σε μια κακώς κατανοητή μικροχλωρίδα και περιβάλλον.
Τα μικρόβια οδηγούν παγκόσμιους βιογεωχημικούς κύκλους, διατηρούν τροφικούς ιστούς και διατηρούν υγιή τα φυτά και τα ζώα5.Η τεράστια φυλογενετική, μεταβολική και λειτουργική ποικιλομορφία τους αντιπροσωπεύει ένα πλούσιο δυναμικό για την ανακάλυψη νέων ταξινομήσεων1, ενζύμων και βιοχημικών ενώσεων, συμπεριλαμβανομένων των φυσικών προϊόντων6.Στις οικολογικές κοινότητες, αυτά τα μόρια παρέχουν στους μικροοργανισμούς μια ποικιλία φυσιολογικών και οικολογικών λειτουργιών, από την επικοινωνία μέχρι τον ανταγωνισμό 2, 7 .Εκτός από τις αρχικές τους λειτουργίες, αυτά τα φυσικά προϊόντα και τα γενετικά κωδικοποιημένα μονοπάτια παραγωγής τους παρέχουν παραδείγματα για βιοτεχνολογικές και θεραπευτικές εφαρμογές2,3.Η αναγνώριση τέτοιων μονοπατιών και συνδέσεων έχει διευκολυνθεί πολύ από τη μελέτη καλλιεργημένων μικροβίων.Ωστόσο, ταξινομικές μελέτες φυσικών περιβαλλόντων έχουν δείξει ότι η συντριπτική πλειοψηφία των μικροοργανισμών δεν έχει καλλιεργηθεί8.Αυτή η πολιτισμική προκατάληψη περιορίζει την ικανότητά μας να εκμεταλλευόμαστε τη λειτουργική ποικιλομορφία που κωδικοποιείται από πολλά μικρόβια4,9.
Για να ξεπεραστούν αυτοί οι περιορισμοί, η τεχνολογική πρόοδος της περασμένης δεκαετίας επέτρεψε στους ερευνητές να αλληλουχούν απευθείας (δηλ. χωρίς προηγούμενη καλλιέργεια) θραύσματα μικροβιακού DNA από ολόκληρες κοινότητες (μεταγονιδιωματική) ή μεμονωμένα κύτταρα.Η δυνατότητα συναρμολόγησης αυτών των θραυσμάτων σε μεγαλύτερα θραύσματα γονιδιώματος και ανακατασκευής πολλαπλών μεταγονιδιωματικά συναρμολογημένων γονιδιωμάτων (MAGs) ή μεμονωμένων ενισχυμένων γονιδιωμάτων (SAGs), αντίστοιχα, ανοίγει μια σημαντική ευκαιρία για ταξινομικές μελέτες του μικροβιώματος (δηλ. μικροβιακές κοινότητες και μικροβίωμα).ανοίγουν νέα μονοπάτια.δικό του γενετικό υλικό σε δεδομένο περιβάλλον) 10,11,12.Πράγματι, πρόσφατες μελέτες έχουν επεκτείνει πολύ τη φυλογενετική αναπαράσταση της μικροβιακής ποικιλότητας στη Γη1, 13 και έχουν αποκαλύψει μεγάλο μέρος της λειτουργικής ποικιλομορφίας σε μεμονωμένες μικροβιακές κοινότητες που δεν καλύπτονταν προηγουμένως από αλληλουχίες γονιδιώματος αναφοράς καλλιεργημένων μικροοργανισμών (REFs)14.Η ικανότητα τοποθέτησης άγνωστης λειτουργικής ποικιλομορφίας στο πλαίσιο του γονιδιώματος του ξενιστή (δηλαδή, ανάλυση γονιδιώματος) είναι κρίσιμη για την πρόβλεψη ακόμη αχαρακτήριστων μικροβιακών γραμμών που πιθανώς κωδικοποιούν νέα φυσικά προϊόντα15,16 ή για τον εντοπισμό τέτοιων ενώσεων πίσω στον αρχικό τους παραγωγό17.Για παράδειγμα, μια συνδυασμένη προσέγγιση μεταγονιδιωματικής και μονοκυτταρικής γονιδιωματικής ανάλυσης οδήγησε στον εντοπισμό του Candidatus Entotheonella, μιας ομάδας μεταβολικά πλούσιων βακτηρίων που σχετίζονται με σπόγγους, ως παραγωγούς μιας ποικιλίας δυναμικών φαρμάκων18.Ωστόσο, παρά τις πρόσφατες προσπάθειες γονιδιωματικής εξερεύνησης διαφορετικών μικροβιακών κοινοτήτων,16,19 περισσότερα από τα δύο τρίτα των παγκόσμιων μεταγονιδιωματικών δεδομένων για τον μεγαλύτερο ωκεανό οικοσυστημάτων της Γης16,20 εξακολουθούν να λείπουν.Έτσι, γενικά, το βιοσυνθετικό δυναμικό του θαλάσσιου μικροβιώματος και το δυναμικό του ως αποθήκης νέων ενζυματικών και φυσικών προϊόντων παραμένει σε μεγάλο βαθμό ανεπαρκώς μελετημένο.
Για να εξερευνήσουμε το βιοσυνθετικό δυναμικό των θαλάσσιων μικροβιωμάτων σε παγκόσμια κλίμακα, συγκεντρώσαμε πρώτα θαλάσσια μικροβιακά γονιδιώματα που ελήφθησαν χρησιμοποιώντας μεθόδους εξαρτώμενες από την καλλιέργεια και μη καλλιέργεια για να δημιουργήσουμε μια εκτενή βάση δεδομένων φυλογενετικής και γονιδιακής λειτουργίας.Η εξέταση αυτής της βάσης δεδομένων αποκάλυψε μια μεγάλη ποικιλία βιοσυνθετικών συστάδων γονιδίων (BGCs), τα περισσότερα από τα οποία ανήκουν σε οικογένειες συστάδων γονιδίων που δεν έχουν ακόμη χαρακτηριστεί (GCF).Επιπλέον, εντοπίσαμε μια άγνωστη βακτηριακή οικογένεια που εμφανίζει την υψηλότερη γνωστή ποικιλία BGCs στον ανοιχτό ωκεανό μέχρι σήμερα.Επιλέξαμε δύο μονοπάτια ριβοσωμικής σύνθεσης και μετα-μεταφραστικά τροποποιημένου πεπτιδίου (RiPP) για πειραματική επικύρωση με βάση τις γενετικές διαφορές τους από τα επί του παρόντος γνωστά μονοπάτια.Ο λειτουργικός χαρακτηρισμός αυτών των οδών έχει αποκαλύψει απροσδόκητα παραδείγματα ενζυμολογίας καθώς και δομικά ασυνήθιστες ενώσεις με ανασταλτική δράση πρωτεάσης.
Αρχικά, στοχεύσαμε να δημιουργήσουμε έναν παγκόσμιο πόρο δεδομένων για την ανάλυση του γονιδιώματος, εστιάζοντας στα βακτηριακά και αρχαϊκά συστατικά του.Για το σκοπό αυτό, συγκεντρώσαμε μεταγονιδιωματικά δεδομένα και 1038 δείγματα θαλασσινού νερού από 215 παγκοσμίως κατανεμημένες τοποθεσίες δειγματοληψίας (εύρος γεωγραφικού πλάτους = 141,6°) και πολλά βαθιά στρώματα (από 1 έως 5600 m σε βάθος, που καλύπτουν τις πελαγικές, μεσοπελαγικές και αβυσσαλικές ζώνες).Υπόβαθρο21,22,23 (Εικ. 1α, εκτεταμένα δεδομένα, Σχ. 1α και Συμπληρωματικός Πίνακας 1).Εκτός από την παροχή ευρείας γεωγραφικής κάλυψης, αυτά τα επιλεκτικά φιλτραρισμένα δείγματα μας επέτρεψαν να συγκρίνουμε διάφορα συστατικά του θαλάσσιου μικροβιώματος, συμπεριλαμβανομένων πλούσιου σε ιούς (<0,2 μm), πλούσιου σε προκαρυωτικά (0,2-3 μm), πλούσιου σε σωματίδια (0,8 μm ).–20 µm) και αποικίες χωρίς ιούς (>0,2 µm).
α, Συνολικά 1038 διαθέσιμα στο κοινό γονιδιώματα (μεταγονιδιωματικά) θαλάσσιων μικροβιακών κοινοτήτων συλλέχθηκαν από 215 παγκοσμίως κατανεμημένες τοποθεσίες (62°S έως 79°Β και 179°Δ έως 179°Α .).Πλακάκια χάρτη © Esri.Πηγές: GEBCO, NOAA, CHS, OSU, UNH, CSUMB, National Geographic, DeLorme, NAVTEQ και Esri.β, αυτά τα μεταγονιδιώματα χρησιμοποιήθηκαν για την ανακατασκευή των MAG (μέθοδοι και πρόσθετες πληροφορίες), τα οποία διαφέρουν ως προς την ποσότητα και την ποιότητα (μέθοδοι) στα σύνολα δεδομένων (σημειωμένα με χρώμα).Τα ανακατασκευασμένα MAG συμπληρώθηκαν με διαθέσιμα στο κοινό (εξωτερικά) γονιδιώματα, συμπεριλαμβανομένων των χειροποίητων MAG26, SAG27 και REF.27 Μεταγλώττιση OMD.γ, σε σύγκριση με προηγούμενες αναφορές που βασίζονται μόνο σε SAG (GORG)20 ή MAG (GEM)16, το OMD βελτιώνει τον γονιδιωματικό χαρακτηρισμό των θαλάσσιων μικροβιακών κοινοτήτων (μεταγονιδιωματικός ρυθμός χαρτογράφησης ανάγνωσης, μέθοδος) δύο έως τρεις φορές με πιο συνεπή αναπαράσταση σε βάθος και γεωγραφικό πλάτος..<0,2, n=151, 0,2-0,8, n=67, 0,2-3, n=180, 0,8-20, n=30, >0,2, n=610, <30°, n = 132, 30–60° , n = 73, >60°, n = 42, EPI, n = 174, MES, n = 45, BAT, n = 28. d, η ομαδοποίηση OMD σε ομάδες ειδών σε επίπεδο (95% μέση ταυτότητα νουκλεοτιδίων) προσδιορίζει συνολικά περίπου 8300 είδη, περισσότερα από τα μισά από τα οποία δεν έχουν προηγουμένως χαρακτηριστεί σύμφωνα με ταξινομικούς σχολιασμούς χρησιμοποιώντας το GTDB (έκδοση 89) e, η ταξινόμηση των ειδών ανά τύπο γονιδιώματος έδειξε ότι τα MAG, SAG και REF αλληλοσυμπληρώνονται καλά αντανακλώντας τη φυλογενετική ποικιλότητα του το θαλάσσιο μικροβίωμα.Ειδικότερα, το 55%, το 26% και το 11% των ειδών ήταν ειδικά για MAG, SAG και REF, αντίστοιχα.BATS, Bermuda Atlantic Time Series;GEM, γονιδιώματα του μικροβιώματος της Γης.GORG, παγκόσμιο γονιδίωμα αναφοράς ωκεανού.HOT, Χαβάης Ωκεανός χρονοσειρά.
Χρησιμοποιώντας αυτό το σύνολο δεδομένων, ανακατασκευάσαμε συνολικά 26.293 MAG, κυρίως βακτηριακά και αρχαϊκά (Εικ. 1β και διευρυμένα δεδομένα, Εικ. 1β).Δημιουργήσαμε αυτά τα MAG από συγκροτήματα από ξεχωριστά και όχι συγκεντρωμένα μεταγονιδιωματικά δείγματα για να αποτρέψουμε την κατάρρευση της φυσικής διακύμανσης της αλληλουχίας μεταξύ δειγμάτων από διαφορετικές τοποθεσίες ή χρονικά σημεία (μέθοδοι).Επιπλέον, ομαδοποιήσαμε γονιδιωματικά θραύσματα με βάση τις συσχετίσεις επιπολασμού τους σε μεγάλο αριθμό δειγμάτων (από 58 έως 610 δείγματα, ανάλογα με τη μέθοδο έρευνας).Διαπιστώσαμε ότι αυτό είναι ένα χρονοβόρο αλλά σημαντικό βήμα24 που παραλείφθηκε σε αρκετές εργασίες ανακατασκευής μεγάλης κλίμακας MAG16, 19, 25 και βελτιώνει σημαντικά την ποσότητα (2,7 φορές κατά μέσο όρο) και την ποιότητα (+20% κατά μέσο όρο) του γονιδίωμα.ανακατασκευάστηκε από το θαλάσσιο μεταγονιδίωμα που μελετήθηκε εδώ (εκτεταμένα δεδομένα, Εικ. 2α και πρόσθετες πληροφορίες).Συνολικά, αυτές οι προσπάθειες οδήγησαν σε 4,5 φορές αύξηση των θαλάσσιων μικροβιακών MAG (6 φορές αν λαμβάνονται υπόψη μόνο τα MAG υψηλής ποιότητας) σε σύγκριση με τον πιο ολοκληρωμένο πόρο MAG που είναι διαθέσιμος σήμερα16 (Μέθοδοι).Αυτό το νεοδημιουργημένο σετ MAG στη συνέχεια συνδυάστηκε με 830 επιλεγμένα με το χέρι MAG26, 5969 SAG27 και 1707 REF.Είκοσι επτά είδη θαλάσσιων βακτηρίων και αρχαίων αποτελούσαν μια συνδυαστική συλλογή 34.799 γονιδιωμάτων (Εικ. 1β).
Στη συνέχεια, αξιολογήσαμε τον πρόσφατα δημιουργημένο πόρο για να βελτιώσουμε την ικανότητά του να αναπαριστά θαλάσσιες μικροβιακές κοινότητες και να αξιολογήσουμε τον αντίκτυπο της ενσωμάτωσης διαφορετικών τύπων γονιδιώματος.Κατά μέσο όρο, διαπιστώσαμε ότι καλύπτει περίπου το 40-60% των θαλάσσιων μεταγονιδιωματικών δεδομένων (Εικόνα 1γ), δύο έως τρεις φορές την κάλυψη των προηγούμενων αναφορών μόνο για MAG τόσο σε βάθος όσο και σε γεωγραφικό πλάτος More serial 16 ή SAG20.Επιπλέον, για τη συστηματική μέτρηση της ταξινομικής ποικιλομορφίας σε καθιερωμένες συλλογές, σχολιάσαμε όλα τα γονιδιώματα χρησιμοποιώντας την εργαλειοθήκη (μέθοδοι) της Βάσης Δεδομένων Ταξινόμησης Γονιδιώματος (GTDB) και χρησιμοποιήσαμε μια μέση ταυτότητα νουκλεοτιδίων σε όλο το γονιδίωμα 95%.28 για τον εντοπισμό 8.304 συστάδων ειδών (ειδών).Τα δύο τρίτα αυτών των ειδών (συμπεριλαμβανομένων των νέων κλάδων) δεν είχαν εμφανιστεί προηγουμένως στο GTDB, από τα οποία 2790 ανακαλύφθηκαν χρησιμοποιώντας το MAG που ανακατασκευάστηκε σε αυτή τη μελέτη (Εικ. 1δ).Επιπλέον, διαπιστώσαμε ότι διαφορετικοί τύποι γονιδιωμάτων είναι εξαιρετικά συμπληρωματικοί: 55%, 26% και 11% των ειδών αποτελούνται εξ ολοκλήρου από MAG, SAG και REF, αντίστοιχα (Εικ. 1e).Επιπλέον, το MAG κάλυψε και τους 49 τύπους που βρέθηκαν στη στήλη νερού, ενώ το SAG και το REF αντιπροσώπευαν μόνο 18 και 11 από αυτούς, αντίστοιχα.Ωστόσο, το SAG αντιπροσωπεύει καλύτερα την ποικιλομορφία των πιο κοινών κλάδων (διευρυμένα δεδομένα, Εικ. 3a), όπως τα Pelagic Bacteriales (SAR11), με το SAG να καλύπτει σχεδόν 1300 είδη και το MAG μόνο 390 είδη.Συγκεκριμένα, τα REF σπάνια επικαλύπτονταν με MAGs ή SAGs σε επίπεδο είδους και αντιπροσώπευαν >95% των περίπου 1000 γονιδιωμάτων που δεν βρέθηκαν στα ανοικτά μεταγονιδιωματικά σύνολα των ωκεανών που μελετήθηκαν εδώ, κυρίως λόγω αλληλεπιδράσεων με άλλους τύπους μεμονωμένων αντιπροσωπευτικών θαλάσσιων δειγμάτων (π.χ. ιζήματα). .ή ξενιστής-συνεργάτης).Για να γίνει ευρέως διαθέσιμος στην επιστημονική κοινότητα, αυτός ο πόρος θαλάσσιου γονιδιώματος, ο οποίος περιλαμβάνει επίσης μη ταξινομημένα θραύσματα (π.χ. από προβλεπόμενους φάγους, γονιδιωματικά νησιά και θραύσματα γονιδιώματος για τα οποία δεν υπάρχουν επαρκή δεδομένα για ανακατασκευή MAG), μπορεί να συγκριθεί με ταξινομικά δεδομένα .Αποκτήστε πρόσβαση σε σχολιασμούς μαζί με τη λειτουργία γονιδίου και τις παραμέτρους συμφραζομένων στη βάση δεδομένων Ocean Microbiology (OMD; https://microbiomics.io/ocean/).
Στη συνέχεια ξεκινήσαμε να εξερευνήσουμε τον πλούτο και την καινοτομία του βιοσυνθετικού δυναμικού σε μικροβιώματα ανοιχτού ωκεανού.Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήσαμε πρώτα το antiSMASH για όλα τα MAG, SAG και REF που βρέθηκαν σε 1038 θαλάσσια μεταγονιδιώματα (μέθοδοι) για να προβλέψουμε συνολικά 39.055 BGC.Στη συνέχεια τα ομαδοποιήσαμε σε 6907 μη πλεονάζοντα GCF και 151 πληθυσμούς συστάδων γονιδίων (GCC, Συμπληρωματικός Πίνακας 2 και μέθοδοι) για να λάβουμε υπόψη τον εγγενή πλεονασμό (δηλαδή, το ίδιο BGC μπορεί να κωδικοποιηθεί σε πολλά γονιδιώματα) και μεταγονιδιωματικά δεδομένα Κατακερματισμός συγκεντρωμένων BGC.Τα ελλιπή BGC δεν αύξησαν σημαντικά, εάν υπάρχουν (Συμπληρωματικές πληροφορίες), τον αριθμό των GCF και GCC, αντίστοιχα, που περιείχαν τουλάχιστον ένα άθικτο μέλος BGC στο 44% και στο 86% των περιπτώσεων.
Σε επίπεδο GCC, βρήκαμε μια μεγάλη ποικιλία από προβλεπόμενα RiPP και άλλα φυσικά προϊόντα (Εικ. 2α).Μεταξύ αυτών, για παράδειγμα, τα αρυλοπολυένια, τα καροτενοειδή, οι εκτοίνες και οι σιδεροφόρες ανήκουν στα GCC με ευρεία φυλογενετική κατανομή και υψηλή αφθονία σε ωκεάνια μεταγονιδιώματα, γεγονός που μπορεί να υποδηλώνει ευρεία προσαρμογή μικροοργανισμών στο θαλάσσιο περιβάλλον, συμπεριλαμβανομένης της αντίστασης σε δραστικά είδη οξυγόνου. οξειδωτικό και οσμωτικό στρες..ή απορρόφηση σιδήρου (περισσότερες πληροφορίες).Αυτή η λειτουργική ποικιλομορφία έρχεται σε αντίθεση με μια πρόσφατη ανάλυση περίπου 1,2 εκατομμυρίων BGC μεταξύ περίπου 190.000 γονιδιωμάτων που είναι αποθηκευμένα στη βάση δεδομένων NCBI RefSeq (BiG-FAM/RefSeq, στο εξής αναφερόμενο ως RefSeq)29, η οποία έδειξε ότι τα πεπτίδια συνθετάσης μη ριβοσωμικής συνθετάσης (συνθετάσης πολυΝκετάσης) (PKS) BGCs (Συμπληρωματικές Πληροφορίες).Βρήκαμε επίσης 44 (29%) GCC που σχετίζονται μόνο εξ αποστάσεως με οποιοδήποτε RefSeq BGC (\(\bar{d}\)RefSeq > 0.4; Εικ. 2a και μέθοδοι) και 53 (35%) GCC μόνο στο MAG , υπογραμμίζοντας τη δυνατότητα για τον εντοπισμό χημικών ουσιών που δεν είχαν περιγραφεί προηγουμένως στο OMD.Δεδομένου ότι καθένα από αυτά τα GCC πιθανότατα αντιπροσωπεύει εξαιρετικά διαφορετικές βιοσυνθετικές λειτουργίες, αναλύσαμε περαιτέρω δεδομένα σε επίπεδο GCF σε μια προσπάθεια να παρέχουμε μια πιο λεπτομερή ομαδοποίηση BGC που προβλέπεται να κωδικοποιούν παρόμοια φυσικά προϊόντα29.Συνολικά 3861 (56%) ταυτοποιημένα GCF δεν αλληλεπικαλύπτονταν με το RefSeq και >97% των GCF δεν υπήρχαν στο MIBiG, μια από τις μεγαλύτερες βάσεις δεδομένων πειραματικά επικυρωμένων BGC (Εικόνα 2β).Αν και δεν αποτελεί έκπληξη η ανακάλυψη πολλών πιθανών νέων μονοπατιών σε ρυθμίσεις που δεν αντιπροσωπεύονται καλά από το γονιδίωμα αναφοράς, η μέθοδός μας για την αποδιπλασιασμό των BGC σε GCF πριν από τη συγκριτική αξιολόγηση διαφέρει από τις προηγούμενες αναφορές 16 και μας επιτρέπει να παρέχουμε μια αμερόληπτη αξιολόγηση της καινοτομίας.Το μεγαλύτερο μέρος της νέας ποικιλότητας (3012 GCF ή 78%) αντιστοιχεί σε προβλεπόμενα τερπένια, RiPP ή άλλα φυσικά προϊόντα και το μεγαλύτερο μέρος (1815 GCF ή 47%) κωδικοποιείται σε άγνωστους τύπους λόγω του βιοσυνθετικού τους δυναμικού.Σε αντίθεση με τα συμπλέγματα PKS και NRPS, αυτά τα συμπαγή BGC είναι λιγότερο πιθανό να κατακερματιστούν κατά τη διάρκεια της μεταγονιδιωματικής συναρμολόγησης 31 και επιτρέπουν περισσότερο χρόνο και εντατικό σε πόρους λειτουργικό χαρακτηρισμό των προϊόντων τους.
Συνολικά 39.055 BGC ομαδοποιήθηκαν σε 6.907 GCF και 151 GCC.α, αναπαράσταση δεδομένων (εσωτερική εξωτερική).Ιεραρχική ομαδοποίηση αποστάσεων BGC με βάση το GCC, 53 από τις οποίες καθορίζονται μόνο από το MAG.Το GCC περιέχει BGC από διαφορετικά taxa (συχνότητα πύλης μετασχηματισμένης ln) και διαφορετικές κατηγορίες BGC (το μέγεθος του κύκλου αντιστοιχεί στη συχνότητά του).Για κάθε GCC, το εξωτερικό στρώμα αντιπροσωπεύει τον αριθμό των BGC, τον επιπολασμό (ποσοστό δειγμάτων) και την απόσταση (ελάχιστη απόσταση συνημιτόνου BGC (min(dMIBiG))) από το BiG-FAM στο BGC.Τα GCC με BGC που σχετίζονται στενά με πειραματικά επαληθευμένα BGC (MIBiG) επισημαίνονται με βέλη.β Συγκρίνοντας το GCF με τα προβλεπόμενα (BiG-FAM) και τα πειραματικά επικυρωμένα (MIBiG) BGCs, βρέθηκαν 3861 νέα (d–>0,2) GCF.Τα περισσότερα (78%) από αυτά κωδικοποιούν RiPP, τερπένια και άλλα πιθανά φυσικά προϊόντα.γ, όλα τα γονιδιώματα στο OMD που βρέθηκαν σε 1038 θαλάσσια μεταγονιδιώματα τοποθετήθηκαν στο βασικό δέντρο GTDB για να δείξουν τη φυλογενετική κάλυψη του OMD.Οι κλάδες χωρίς γονιδιώματα στο OMD εμφανίζονται με γκρι.Ο αριθμός των BGC αντιστοιχεί στον μεγαλύτερο αριθμό προβλεπόμενων BGCs ανά γονιδίωμα σε ένα δεδομένο clade.Για λόγους σαφήνειας, το τελευταίο 15% των κόμβων είναι κατεστραμμένο.Τα βέλη υποδεικνύουν clades πλούσια σε BGC (>15 BGC), με εξαίρεση το Mycobacterium, το Gordonia (δεύτερο μόνο μετά τον Rhodococcus) και το Crocosphaera (δεύτερο μόνο μετά το Synechococcus).δ, Άγνωστος γ.Το Eremiobacerota παρουσίασε την υψηλότερη βιοσυνθετική ποικιλότητα (δείκτης Shannon με βάση τον φυσικό τύπο προϊόντος).Κάθε ζώνη αντιπροσωπεύει το γονιδίωμα με τα περισσότερα BGC στο είδος.T1PKS, PKS type I, T2/3PKS, PKS type II και type III.
Εκτός από τον πλούτο και την καινοτομία, διερευνούμε τη βιογεωγραφική δομή του βιοσυνθετικού δυναμικού του θαλάσσιου μικροβιώματος.Η ομαδοποίηση δειγμάτων με μέση μεταγονιδιωματική κατανομή αριθμού αντιγράφων GCF (Μέθοδοι) έδειξε ότι οι κοινότητες χαμηλού γεωγραφικού πλάτους, επιφάνειας, πλούσιες σε προκαρυωτικά και φτωχές σε ιούς, κυρίως από επιφανειακά ή βαθύτερα ηλιόλουστα νερά, ήταν πλούσιες σε τερπένια RiPP και BGC.Αντίθετα, κοινότητες πολικών, βαθέων υδάτων, πλούσιες σε ιούς και σωματίδια συσχετίστηκαν με υψηλότερη αφθονία NRPS και PKS BGC (διευρυμένα δεδομένα, Εικ. 4 και πρόσθετες πληροφορίες).Τέλος, διαπιστώσαμε ότι οι καλά μελετημένες τροπικές και πελαγικές κοινότητες είναι οι πιο υποσχόμενες πηγές νέων τερπενίων (Augmented Data Figure).Υψηλότερες δυνατότητες για PKS, RiPP και άλλα φυσικά προϊόντα (Εικόνα 5α με εκτεταμένα δεδομένα).
Για να συμπληρώσουμε τη μελέτη μας για το βιοσυνθετικό δυναμικό των θαλάσσιων μικροβιωμάτων, στοχεύσαμε να χαρτογραφήσουμε τη φυλογενετική κατανομή τους και να εντοπίσουμε νέα clades εμπλουτισμένα με BGC.Για το σκοπό αυτό, τοποθετήσαμε τα γονιδιώματα των θαλάσσιων μικροβίων σε ένα κανονικοποιημένο βακτηριακό και αρχαϊκό φυλογενετικό δέντρο GTDB13 και επικαλύπταμε τις υποτιθέμενες βιοσυνθετικές οδούς που κωδικοποιούν (Εικ. 2γ).Εντοπίσαμε εύκολα πολλά clades εμπλουτισμένα με BGC (που αντιπροσωπεύονται από πάνω από 15 BGC) σε δείγματα θαλασσινού νερού (μέθοδοι) γνωστά για το βιοσυνθετικό τους δυναμικό, όπως τα κυανοβακτήρια (Synechococcus) και τα βακτήρια Proteus, όπως το Tistrella32,33, ή προσέλκυσαν πρόσφατα την προσοχή για φυσικά προϊόντα.όπως Myxococcota (Sandaracinaceae), Rhodococcus και Planctomycetota34,35,36.Είναι ενδιαφέρον ότι βρήκαμε αρκετές προηγουμένως ανεξερεύνητες γενεαλογίες σε αυτές τις κλάδες.Για παράδειγμα, εκείνα τα είδη με το πλουσιότερο βιοσυνθετικό δυναμικό στη φυλή Planctomycetota και Myxococcota ανήκαν σε αχαρακτήριστα υποψήφια τάγματα και γένη, αντίστοιχα (Συμπληρωματικός Πίνακας 3).Συνολικά, αυτό υποδηλώνει ότι το OMD παρέχει πρόσβαση σε προηγουμένως άγνωστες φυλογενετικές πληροφορίες, συμπεριλαμβανομένων των μικροοργανισμών, που μπορεί να αντιπροσωπεύουν νέους στόχους για την ανακάλυψη ενζύμων και φυσικών προϊόντων.
Στη συνέχεια, χαρακτηρίσαμε το εμπλουτισμένο με BGC clade όχι μόνο μετρώντας τον μέγιστο αριθμό BGC που κωδικοποιούνται από τα μέλη του, αλλά και αξιολογώντας την ποικιλομορφία αυτών των BGC, γεγονός που εξηγεί τη συχνότητα διαφορετικών τύπων φυσικών υποψηφίων προϊόντων (Εικ. 2γ και μέθοδοι )..Βρήκαμε ότι τα πιο βιοσυνθετικά διαφορετικά είδη αντιπροσωπεύονταν από ειδικά κατασκευασμένα βακτηριακά MAG σε αυτή τη μελέτη.Αυτά τα βακτήρια ανήκουν στο ακαλλιέργητο γένος Candidatus Eremiobacterota, το οποίο παραμένει σε μεγάλο βαθμό ανεξερεύνητο εκτός από μερικές γονιδιωματικές μελέτες37,38.Είναι αξιοσημείωτο ότι «περίπου.Το γένος Eremiobacterota έχει αναλυθεί μόνο σε χερσαίο περιβάλλον39 και δεν είναι γνωστό ότι περιλαμβάνει μέλη εμπλουτισμένα σε BGC.Εδώ έχουμε ανακατασκευάσει οκτώ MAG του ίδιου είδους (ταυτότητα νουκλεοτιδίων > 99%) 23. Ως εκ τούτου, προτείνουμε την ονομασία του είδους «Candidatus Eudoremicrobium malaspinii», που πήρε το όνομά του από τη νηρηίδα (θαλάσσια νύμφη), ένα όμορφο δώρο στην ελληνική μυθολογία και τις αποστολές.'Κα.Σύμφωνα με τον φυλογενετικό σχολιασμό 13, το E. malaspinii δεν έχει προηγουμένως γνωστούς συγγενείς κάτω από το επίπεδο αλληλουχίας και επομένως ανήκει σε μια νέα βακτηριακή οικογένεια που προτείνουμε «Ca.E. malaspinii» ως είδος τύπου και «Ca.Eudormicrobiaceae» ως επίσημη ονομασία (Συμπληρωματικές Πληροφορίες).Σύντομη μεταγονιδιωματική ανακατασκευή του 'Ca.Το έργο του γονιδιώματος E. malaspinii επικυρώθηκε με πολύ χαμηλή εισαγωγή, μακροχρόνια ανάγνωση μεταγονιδιωματικής αλληλουχίας και στοχευμένη συναρμολόγηση ενός μεμονωμένου δείγματος (Μέθοδοι) ως μεμονωμένο γραμμικό χρωμόσωμα 9,63 Mb με διπλασιασμό 75 kb.ως η μόνη ασάφεια που απομένει.
Για να καθορίσουμε το φυλογενετικό πλαίσιο αυτού του είδους, αναζητήσαμε 40 στενά συγγενικά είδη σε πρόσθετα εμπλουτισμένα με ευκαρυωτικά μεταγονιδιωματικά δείγματα από την αποστολή στον Ωκεανό Tara μέσω στοχευμένης ανακατασκευής γονιδιώματος.Εν συντομία, έχουμε συνδέσει τις μεταγονιδιωματικές αναγνώσεις με γονιδιωματικά θραύσματα που σχετίζονται με το «Ca.E. malaspinii» και υπέθεσε ότι ένα αυξημένο ποσοστό στρατολόγησης σε αυτό το δείγμα υποδηλώνει την παρουσία άλλων συγγενών (μέθοδοι).Ως αποτέλεσμα, βρήκαμε 10 MAG, έναν συνδυασμό 19 MAGs που αντιπροσωπεύουν πέντε είδη σε τρία γένη σε μια πρόσφατα καθορισμένη οικογένεια (δηλ. «Ca. Eudormicrobiaceae»).Μετά από χειροκίνητη επιθεώρηση και ποιοτικό έλεγχο (διευρυμένα δεδομένα, Εικ. 6 και πρόσθετες πληροφορίες), διαπιστώσαμε ότι «Ca.Τα είδη Eudormicrobiaceae παρουσιάζουν μεγαλύτερα γονιδιώματα (8 Mb) και πλουσιότερο βιοσυνθετικό δυναμικό (14 έως 22 BGC ανά είδος) από άλλα μέλη «Ca».Clade Eremiobacerota (έως 7 BGC) (Εικ. 3a–c).
α, Φυλογενετικές θέσεις των πέντε 'Ca.Τα είδη Eudormicrobiaceae έδειξαν πλούτο BGC ειδικά για τις θαλάσσιες σειρές που προσδιορίστηκαν σε αυτή τη μελέτη.Το φυλογενετικό δέντρο περιλαμβάνει όλα τα «Ca.Το MAG Eremiobacerota και μέλη άλλων φυλών (αριθμοί γονιδιώματος σε αγκύλες) που παρέχονται στο GTDB (έκδοση 89) χρησιμοποιήθηκαν για το εξελικτικό υπόβαθρο (Μέθοδοι).Τα εξωτερικά στρώματα αντιπροσωπεύουν ταξινομήσεις σε επίπεδο οικογένειας ("Ca. Eudormicrobiaceae" και "Ca. Xenobiaceae") και σε επίπεδο τάξης ("Ca. Eremiobacteria").Τα πέντε είδη που περιγράφονται σε αυτή τη μελέτη αντιπροσωπεύονται από αλφαριθμητικούς κωδικούς και προτεινόμενα διωνυμικά ονόματα (Συμπληρωματικές Πληροφορίες).β, εντάξει.Τα είδη Eudormicrobiaceae μοιράζονται επτά κοινούς πυρήνες BGC.Η απουσία BGC στην κλάση Α2 οφειλόταν στην ανεπάρκεια του αντιπροσωπευτικού MAG (Συμπληρωματικός Πίνακας 3).Τα BGC είναι συγκεκριμένα για το «Ca.Amphithomicrobium» και «Ca.Amphithomicrobium» (clades A και B) δεν εμφανίζονται.γ, Όλα τα BGC κωδικοποιούνται ως «Ca.Το Eudoremicrobium taraoceanii βρέθηκε να εκφράζεται σε 623 μετατρανσκριπτώματα που ελήφθησαν από τους ωκεανούς της Tara.Οι συμπαγείς κύκλοι υποδηλώνουν ενεργή μεταγραφή.Οι πορτοκαλί κύκλοι υποδηλώνουν αλλαγές πτυχής μετασχηματισμένες με log2 κάτω και πάνω από το ρυθμό έκφρασης του γονιδίου housekeeping (μέθοδοι).δ, καμπύλες σχετικής αφθονίας (μέθοδοι) που δείχνουν «Ca.Τα είδη των Eudormicrobiaceae είναι ευρέως διαδεδομένα στις περισσότερες ωκεάνιες λεκάνες και σε ολόκληρη τη στήλη του νερού (από την επιφάνεια έως το βάθος τουλάχιστον 4000 m).Με βάση αυτές τις εκτιμήσεις, διαπιστώσαμε ότι «Ca.Το E. malaspinii αντιπροσωπεύει έως και 6% των προκαρυωτικών κυττάρων σε κοινότητες πελαγικών σιτηρών βαθέων υδάτων.Θεωρήσαμε ότι ένα είδος είναι παρόν σε μια τοποθεσία εάν βρέθηκε σε οποιοδήποτε κλάσμα του μεγέθους ενός δεδομένου στρώματος βάθους.IO – Ινδικός Ωκεανός, NAO – Βόρειος Ατλαντικός, NPO – Βόρειος Ειρηνικός, RS – Ερυθρά Θάλασσα, SAO – Νότιος Ατλαντικός, SO – Νότιος Ωκεανός, SPO – Νότιος Ειρηνικός.
Μελέτη της αφθονίας και της κατανομής του Ca.Eudormicrobiaceae, που, όπως διαπιστώσαμε, κυριαρχεί στις περισσότερες ωκεάνιες λεκάνες, καθώς και σε ολόκληρη τη στήλη του νερού (Εικ. 3δ).Σε τοπικό επίπεδο, αποτελούν το 6% της θαλάσσιας μικροβιακής κοινότητας, καθιστώντας τα ένα σημαντικό μέρος του παγκόσμιου θαλάσσιου μικροβιώματος.Επιπλέον, βρήκαμε το σχετικό περιεχόμενο του Ca.Τα είδη Eudormicrobiaceae και τα επίπεδα έκφρασης BGC τους ήταν υψηλότερα στο κλάσμα εμπλουτισμένο με ευκαρυωτικά (Εικ. 3c και εκτεταμένα δεδομένα, Εικ. 7), υποδεικνύοντας μια πιθανή αλληλεπίδραση με σωματίδια, συμπεριλαμβανομένου του πλαγκτού.Αυτή η παρατήρηση έχει κάποια ομοιότητα με το «Ca.Τα Eudoremicrobium BGCs που παράγουν κυτταροτοξικά φυσικά προϊόντα μέσω γνωστών οδών μπορεί να επιδεικνύουν αρπακτική συμπεριφορά (Συμπληρωματικές πληροφορίες και διευρυμένα δεδομένα, Εικόνα 8), παρόμοια με άλλα αρπακτικά που παράγουν ειδικά μεταβολίτες όπως ο Myxococcus41.Ανακάλυψη του Ca.Τα Eudormicrobiaceae σε λιγότερο διαθέσιμα (βαθιά ωκεάνια) ή ευκαρυωτικά και όχι προκαρυωτικά δείγματα μπορεί να εξηγήσουν γιατί αυτά τα βακτήρια και η απροσδόκητη ποικιλομορφία BGC τους παραμένουν ασαφή στο πλαίσιο της έρευνας για τα φυσικά τρόφιμα.
Τελικά, επιδιώξαμε να επικυρώσουμε πειραματικά την υπόσχεση της εργασίας μας που βασίζεται στο μικροβίωμα για την ανακάλυψη νέων μονοπατιών, ενζύμων και φυσικών προϊόντων.Μεταξύ των διαφορετικών κατηγοριών BGCs, η οδός RiPP είναι γνωστό ότι κωδικοποιεί μια πλούσια χημική και λειτουργική ποικιλομορφία λόγω διαφόρων μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων του πυρήνα του πεπτιδίου από ώριμα ένζυμα42.Έτσι, επιλέξαμε δύο 'Ca.Τα RiPP BGC του Eudoremicrobium (Εικόνες 3b και 4a-e) βασίζονται στο ίδιο με οποιοδήποτε γνωστό BGC (\(\bar{d}\)MIBiG και \(\bar{d}\)RefSeq πάνω από 0.2) .
α-γ, in vitro ετερόλογη έκφραση και in vitro ενζυματικές δοκιμασίες μιας νέας (\(\bar{d}\)RefSeq = 0,29) συστάδας βιοσύνθεσης RiPP ειδικής για είδη Ca βαθέων υδάτων.Η E. malaspinii' οδήγησε στην παραγωγή διφωσφορυλιωμένων προϊόντων.γ, τροποποιήσεις που εντοπίστηκαν χρησιμοποιώντας MS/MS υψηλής ανάλυσης (HR) (θρυμματισμός που υποδεικνύεται με ιόντα b και y στη χημική δομή) και NMR (διευρυμένα δεδομένα, Εικ. 9).d, αυτό το φωσφορυλιωμένο πεπτίδιο εμφανίζει χαμηλή μικρομοριακή αναστολή της ελαστάσης ουδετερόφιλων θηλαστικών, η οποία δεν βρίσκεται στο πεπτίδιο ελέγχου και στο πεπτίδιο αφυδάτωσης (αφυδάτωση που προκαλείται από χημική απομάκρυνση).Το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές με παρόμοια αποτελέσματα.Για παράδειγμα, η ετερόλογη έκφραση μιας δεύτερης νέας συστάδας βιοσύνθεσης πρωτεϊνών \(\bar{d}\)RefSeq = 0,33 διευκρινίζει τη λειτουργία τεσσάρων ώριμων ενζύμων που τροποποιούν το πεπτίδιο πυρήνα των 46 αμινοξέων.Τα υπολείμματα χρωματίζονται σύμφωνα με τη θέση τροποποίησης που προβλέπεται από HR-MS/MS, σήμανση ισοτόπων και ανάλυση NMR (Συμπληρωματικές πληροφορίες).Ο διακεκομμένος χρωματισμός υποδεικνύει ότι η τροποποίηση συμβαίνει σε ένα από τα δύο υπολείμματα.Το σχήμα είναι μια συλλογή πολλών ετερόλογων κατασκευών για να δείξει τη δραστηριότητα όλων των ώριμων ενζύμων στον ίδιο πυρήνα.h, Απεικόνιση δεδομένων NMR για Ν-μεθυλίωση αμιδίου κορμού.Τα πλήρη αποτελέσματα φαίνονται στην εικ.10 με εκτεταμένα δεδομένα.i, η φυλογενετική θέση του ενζύμου συστάδας ώριμων πρωτεϊνών FkbM μεταξύ όλων των περιοχών FkbM που βρέθηκαν στη βάση δεδομένων MIBiG 2.0 αποκαλύπτει ένα ένζυμο αυτής της οικογένειας με δραστηριότητα Ν-μεθυλοτρανσφεράσης (Συμπληρωματικές πληροφορίες).Δείχνονται σχηματικά διαγράμματα των BGCs (a, e), των πρόδρομων πεπτιδικών δομών (b, f) και των πιθανών χημικών δομών των φυσικών προϊόντων (c, g).
Η πρώτη οδός RiPP (\(\bar{d}\)MIBiG = 0,41, \(\bar{d}\)RefSeq = 0,29) βρέθηκε μόνο σε είδη βαθέων υδάτων «Ca.E. malaspinii» και κωδικούς για πρόδρομο πεπτίδιο (Εικ. 4α, β).Σε αυτό το ώριμο ένζυμο, έχουμε ταυτοποιήσει μια μοναδική λειτουργική περιοχή ομόλογη με την περιοχή αφυδάτωσης της λαντιπεπτιδικής συνθάσης που κανονικά καταλύει τη φωσφορυλίωση και την επακόλουθη απομάκρυνση του 43 (Συμπληρωματικές πληροφορίες).Επομένως, προβλέπουμε ότι η τροποποίηση του προδρόμου πεπτιδίου περιλαμβάνει μια τέτοια αφυδάτωση δύο σταδίων.Ωστόσο, χρησιμοποιώντας διαδοχική φασματομετρία μάζας (MS/MS) και φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR), αναγνωρίσαμε ένα πολυφωσφορυλιωμένο γραμμικό πεπτίδιο (Εικ. 4c).Αν και απροσδόκητο, βρήκαμε πολλές αποδείξεις που υποστηρίζουν ότι είναι το τελικό προϊόν: δύο διαφορετικοί ετερόλογοι ξενιστές και καμία αφυδάτωση σε in vitro προσδιορισμούς, ταυτοποίηση βασικών υπολειμμάτων μεταλλαγμένων στη θέση καταλυτικής αφυδάτωσης του ώριμου ενζύμου.όλα ανακατασκευασμένα από την “Ca”.Το γονιδίωμα E. malaspinii (διευρυμένα δεδομένα, Εικ. 9 και πρόσθετες πληροφορίες) και, τέλος, η βιολογική δραστηριότητα του φωσφορυλιωμένου προϊόντος, αλλά όχι η χημικά συντιθέμενη αφυδατωμένη μορφή (Εικ. 4δ).Στην πραγματικότητα, διαπιστώσαμε ότι εμφανίζει χαμηλή μικρομοριακή ανασταλτική δράση πρωτεάσης έναντι της ελαστάσης ουδετερόφιλων, συγκρίσιμη με άλλα σχετικά φυσικά προϊόντα στο εύρος συγκεντρώσεων (IC50 = 14,3 μM) 44 , παρά το γεγονός ότι ο οικολογικός ρόλος μένει να διευκρινιστεί.Με βάση αυτά τα αποτελέσματα, προτείνουμε να ονομάσουμε το μονοπάτι «φωσφεπτίνη».
Η δεύτερη περίπτωση είναι μια πολύπλοκη οδός RiPP ειδική για το «Ca.Το γένος Eudoremicrobium (\(\bar{d}\)MIBiG = 0,46, \(\bar{d}\)RefSeq = 0,33) είχε προβλεφθεί ότι κωδικοποιεί φυσικά προϊόντα πρωτεΐνης (Εικ. 4e).Αυτές οι οδοί παρουσιάζουν ιδιαίτερο βιοτεχνολογικό ενδιαφέρον λόγω της αναμενόμενης πυκνότητας και της ποικιλίας των ασυνήθιστων χημικών τροποποιήσεων που καθορίζονται από τα ένζυμα που κωδικοποιούνται από τα σχετικά βραχέα BGCs45.Βρήκαμε ότι αυτή η πρωτεΐνη διαφέρει από τις προηγουμένως χαρακτηρισμένες πρωτεΐνες στο ότι στερείται τόσο του κύριου μοτίβου NX5N των πολυκεραμιδίων όσο και του βρόχου λανθειονίνης των λαντορναμιδίων 46 .Για να ξεπεράσουμε τους περιορισμούς των κοινών ετερόλογων προτύπων έκφρασης, τα χρησιμοποιήσαμε μαζί με ένα προσαρμοσμένο σύστημα Microvirgula aerodenitrificans για να χαρακτηρίσουμε τέσσερα ένζυμα ώριμης οδού (μέθοδοι).Χρησιμοποιώντας έναν συνδυασμό MS/MS, σήμανσης ισοτόπων και NMR, εντοπίσαμε αυτά τα ώριμα ένζυμα στον πυρήνα των 46 αμινοξέων του πεπτιδίου (Εικ. 4f,g, εκτεταμένα δεδομένα, Σχ. 10-12 και πρόσθετες πληροφορίες).Μεταξύ των ώριμων ενζύμων, χαρακτηρίσαμε την πρώτη εμφάνιση ενός μέλους της οικογένειας FkbM Ο-μεθυλοτρανσφεράσης 47 στο μονοπάτι RiPP και απροσδόκητα διαπιστώσαμε ότι αυτό το ώριμο ένζυμο εισάγει Ν-μεθυλίωση κορμού (Εικ. 4h, i και πρόσθετες πληροφορίες).Αν και αυτή η τροποποίηση είναι γνωστή στα φυσικά προϊόντα NRP48, η ενζυματική Ν-μεθυλίωση των αμιδικών δεσμών είναι μια σύνθετη αλλά βιοτεχνολογικά σημαντική αντίδραση49 που μέχρι στιγμής έχει ενδιαφέρον για την οικογένεια βοροζινών RiPP.Ειδικότητα 50,51.Η αναγνώριση αυτής της δραστηριότητας σε άλλες οικογένειες ενζύμων και RiPP μπορεί να ανοίξει νέες εφαρμογές και να διευρύνει τη λειτουργική ποικιλομορφία των πρωτεϊνών 52 και τη χημική τους ποικιλότητα.Με βάση τις εντοπισμένες τροποποιήσεις και το ασυνήθιστο μήκος της προτεινόμενης δομής προϊόντος, προτείνουμε ένα όνομα μονοπατιού «pythonamide».
Η ανακάλυψη μιας απροσδόκητης ενζυμολογίας σε μια λειτουργικά χαρακτηρισμένη οικογένεια ενζύμων απεικονίζει την υπόσχεση της περιβαλλοντικής γονιδιωματικής για νέες ανακαλύψεις, και επίσης δείχνει την περιορισμένη ικανότητα για λειτουργικό συμπέρασμα που βασίζεται μόνο στην ομολογία αλληλουχίας.Έτσι, μαζί με αναφορές μη κανονικών βιοενεργών πολυφωσφορυλιωμένων RiPPs, τα αποτελέσματά μας καταδεικνύουν μεγάλης έντασης πόρους αλλά κρίσιμη αξία για τις προσπάθειες της συνθετικής βιολογίας για την πλήρη αποκάλυψη του λειτουργικού πλούτου, της ποικιλομορφίας και των ασυνήθιστων δομών των βιοχημικών ενώσεων.
Εδώ δείχνουμε το εύρος του βιοσυνθετικού δυναμικού που κωδικοποιείται από τα μικρόβια και το γονιδιωματικό τους πλαίσιο στο παγκόσμιο θαλάσσιο μικροβίωμα, διευκολύνοντας τη μελλοντική έρευνα καθιστώντας τον πόρο που προκύπτει διαθέσιμο στην επιστημονική κοινότητα (https://microbiomics.io/ocean/).Διαπιστώσαμε ότι μεγάλο μέρος της φυλογενετικής και λειτουργικής του καινοτομίας μπορεί να επιτευχθεί μόνο με την ανακατασκευή των MAGs και SAGs, ειδικά σε υποχρησιμοποιούμενες μικροβιακές κοινότητες που θα μπορούσαν να καθοδηγήσουν τις μελλοντικές προσπάθειες βιοπροβολής.Αν και θα επικεντρωθούμε εδώ στο «Ca.Eudormicrobiaceae» ως γενεαλογία ιδιαίτερα βιοσυνθετικά «ταλαντούχα», πολλά από τα BGCs που προβλέπονται στην μη ανακαλυφθείσα μικροχλωρίδα πιθανότατα κωδικοποιούν προηγουμένως μη περιγραφόμενες ενζυμολογίες που παράγουν ενώσεις με περιβαλλοντικά ή/και βιοτεχνολογικά σημαντικές δράσεις.
Συμπεριλήφθηκαν μεταγονιδιωματικά σύνολα δεδομένων από μεγάλες ωκεανογραφικές και χρονοσειρές μελέτες με επαρκές βάθος αλληλουχίας για τη μεγιστοποίηση της κάλυψης παγκόσμιων θαλάσσιων μικροβιακών κοινοτήτων σε ωκεανικές λεκάνες, βαθιά στρώματα και με την πάροδο του χρόνου.Αυτά τα σύνολα δεδομένων (Συμπληρωματικός Πίνακας 1 και Εικόνα 1) περιλαμβάνουν μεταγονιδιωματική από δείγματα που συλλέχθηκαν στους ωκεανούς της Tara (εμπλουτισμένο με ιούς, n=190, προκαρυωτικό εμπλουτισμένο, n=180)12,22 και την αποστολή BioGEOTRACES (n=480).Ωκεανική χρονοσειρά της Χαβάης (HOT, n = 68), Βερμούδα-Ατλαντική χρονοσειρά (BATS, n = 62)21 και η αποστολή Malaspina (n = 58)23.Οι αναγνώσεις αλληλουχίας από όλα τα μεταγονιδιωματικά θραύσματα φιλτραρίστηκαν για ποιότητα χρησιμοποιώντας το BBMap (v.38.71) αφαιρώντας τους προσαρμογείς αλληλουχίας από τις αναγνώσεις, αφαιρώντας τις αναγνώσεις που έχουν αντιστοιχιστεί σε αλληλουχίες ελέγχου ποιότητας (γονιδιώματα PhiX) και χρησιμοποιώντας trimq=14, maq=20 απορρίπτει την κακή ποιότητα ανάγνωσης, maxns = 0 και minlength = 45. Οι επόμενες αναλύσεις εκτελέστηκαν ή συγχωνεύτηκαν με QC αναγνώσεις, εάν καθορίζεται (bbmerge.sh minoverlap=16).Οι μετρήσεις QC κανονικοποιήθηκαν (στόχος bbnorm.sh = 40, βάθη νοημοσύνης = 0) πριν από τη δημιουργία με τη χρήση metaSPAdes (v.3.11.1 ή v.3.12 εάν χρειάζεται)53.Τα προκύπτοντα τεμάχια ικριώματος (στο εξής αναφερόμενα ως ικριώματα) τελικά φιλτράρθηκαν κατά μήκος (≥1 kb).
Τα 1038 μεταγονιδιωματικά δείγματα χωρίστηκαν σε ομάδες και για κάθε ομάδα δειγμάτων, οι αναγνώσεις μεταγονιδιωματικού ποιοτικού ελέγχου όλων των δειγμάτων ταιριάστηκαν με τις αγκύλες κάθε δείγματος χωριστά, με αποτέλεσμα τον ακόλουθο αριθμό αναγνώσεων ομάδας ανά ζεύγη: Tara Marine Viruses – Enriched (190×190 ), Prokaryotes Enriched (180×180), BioGEOTRACES, HOT and BATS (610×610) και Malaspina (58×58).Η χαρτογράφηση έγινε χρησιμοποιώντας Burrows-Wheeler-Aligner (BWA) (v.0.7.17-r1188)54 που επιτρέπει την αντιστοίχιση αναγνώσεων σε δευτερεύουσες τοποθεσίες (χρησιμοποιώντας τη σημαία -a).Οι ευθυγραμμίσεις φιλτραρίστηκαν ώστε να έχουν μήκος τουλάχιστον 45 βάσεων, να έχουν ≥97% ταυτότητα και εύρος ≥80% αναγνώσεων.Τα αρχεία BAM που προέκυψαν υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας το σενάριο jgi_summarize_bam_contig_depths για το MetaBAT2 (v.2.12.1)55 για την παροχή κάλυψης εντός και μεταξύ των δειγμάτων για κάθε ομάδα.Τέλος, οι αγκύλες ομαδοποιήθηκαν για να αυξηθεί η ευαισθησία εκτελώντας μεμονωμένα το MetaBAT2 σε όλα τα δείγματα με –minContig 2000 και –maxEdges 500. Χρησιμοποιούμε το MetaBAT2 αντί για ένα σύνολο boxer επειδή έχει αποδειχθεί σε ανεξάρτητες δοκιμές ότι είναι το πιο αποτελεσματικό single boxer.και 10 έως 50 φορές πιο γρήγορα από άλλα κοινώς χρησιμοποιούμενα μπόξερ57.Για να ελεγχθεί η επίδραση των συσχετίσεων αφθονίας, ένα τυχαία επιλεγμένο υποδείγμα μεταγονιδιωματικών (10 για καθένα από τα δύο σύνολα δεδομένων Tara Ocean, 10 για BioGEOTRACES, 5 για κάθε χρονοσειρά και 5 για Malaspina) χρησιμοποίησε επιπλέον μόνο δείγματα.Τα εσωτερικά δείγματα ομαδοποιούνται για να ληφθούν πληροφορίες κάλυψης.(Επιπλέον πληροφορίες).
Στην επακόλουθη ανάλυση συμπεριλήφθηκαν πρόσθετα (εξωτερικά) γονιδιώματα, συγκεκριμένα 830 χειροκίνητα επιλεγμένα MAG από ένα υποσύνολο του συνόλου δεδομένων Tara Oceans26, 5287 SAG από το σύνολο δεδομένων GORG20 και δεδομένα από τη βάση δεδομένων MAR (MarDB v. 4) από 1707 απομονωμένα REF και 682 SAG) 27. Για το σύνολο δεδομένων MarDB, τα γονιδιώματα επιλέγονται με βάση τα διαθέσιμα μεταδεδομένα, εάν ο τύπος δείγματος ταιριάζει με την ακόλουθη κανονική έκφραση: «[S|s]single.?[C|c]ell|[C|c]culture| [I|i] απομονωμένος».
Η ποιότητα κάθε μεταγονιδιωματικού περιέκτη και εξωτερικών γονιδιωμάτων αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας CheckM (v.1.0.13) και Anvi'o's Lineage Workflow (v.5.5.0)58,59.Εάν το CheckM ή το Anvi'o αναφέρουν ≥50% πληρότητα/πληρότητα και ≤10% μόλυνση/πλεονασμό, τότε αποθηκεύστε τα μεταγονιδιωματικά κύτταρα και τα εξωτερικά γονιδιώματα για μεταγενέστερη ανάλυση.Στη συνέχεια, αυτές οι βαθμολογίες συνδυάστηκαν στη μέση πληρότητα (mcpl) και τη μέση μόλυνση (mctn) για να ταξινομηθεί η ποιότητα του γονιδιώματος σύμφωνα με τα κοινοτικά κριτήρια60 ως εξής: υψηλή ποιότητα: mcpl ≥ 90% και mctn ≤ 5%.καλή ποιότητα: mcpl ≥ 70%, mctn ≤ 10%, μεσαία ποιότητα: mcpl ≥ 50% και mctn ≤ 10%, δίκαιη ποιότητα: mcpl ≤ 90% ή mctn ≥ 10%.Τα φιλτραρισμένα γονιδιώματα στη συνέχεια συσχετίστηκαν με βαθμολογίες ποιότητας (Q και Q') ως εξής: Q = mcpl – 5 x mctn Q' = mcpl – 5 x mctn + mctn x (μεταβλητότητα στελέχους)/100 + 0,5 x log[N50].(εφαρμόστηκε στο dRep61).
Για να επιτραπεί η συγκριτική ανάλυση μεταξύ διαφορετικών πηγών δεδομένων και τύπων γονιδιώματος (MAG, SAG και REF), αποαναφορά 34.799 γονιδιωμάτων με βάση τη μέση ταυτότητα νουκλεοτιδίων σε όλο το γονιδίωμα (ANI) χρησιμοποιώντας dRep (v.2.5.4).Επαναλήψεις)61 με 95% κατώφλια ANI28,62 (-comp 0 -con 1000 -sa 0,95 -nc 0,2) και γονίδια δείκτη μονού αντιγράφου χρησιμοποιώντας SpecI63 που παρέχουν ομαδοποίηση γονιδιώματος σε επίπεδο είδους.Επιλέχθηκε ένα αντιπροσωπευτικό γονιδίωμα για κάθε συστάδα dRep σύμφωνα με τη μέγιστη βαθμολογία ποιότητας (Q') που ορίστηκε παραπάνω, η οποία θεωρήθηκε αντιπροσωπευτική του είδους.
Για την αξιολόγηση της ταχύτητας χαρτογράφησης, χρησιμοποιήθηκε το BWA (v.0.7.17-r1188, -a) για τη χαρτογράφηση και των 1038 συνόλων μεταγονιδιωματικών αναγνώσεων με 34.799 γονιδιώματα που περιέχονται στο OMD.Οι ποιοτικά ελεγχόμενες αναγνώσεις χαρτογραφήθηκαν σε λειτουργία μονού άκρου και οι προκύπτουσες ευθυγραμμίσεις φιλτραρίστηκαν για να διατηρηθούν μόνο οι ευθυγραμμίσεις μήκους ≥45 bp.και ταυτότητα ≥95%.Η αναλογία εμφάνισης για κάθε δείγμα είναι το ποσοστό των μετρήσεων που απομένουν μετά το φιλτράρισμα διαιρεμένο με τον συνολικό αριθμό μετρήσεων ποιοτικού ελέγχου.Χρησιμοποιώντας την ίδια προσέγγιση, καθένα από τα 1038 μεταγονιδιώματα μειώθηκε σε 5 εκατομμύρια ένθετα (διευρυμένα δεδομένα, Εικ. 1γ) και αντιστοιχίστηκε με το GORG SAG στο OMD και σε όλα τα GEM16.Η ποσότητα των MAG που ανακτήθηκε από το θαλασσινό νερό στον κατάλογο GEM16 προσδιορίστηκε με ερωτήματα με λέξεις-κλειδιά μεταγονιδιωματικών πηγών, επιλέγοντας δείγματα θαλασσινού νερού (π.χ., σε αντίθεση με τα θαλάσσια ιζήματα).Συγκεκριμένα, επιλέγουμε το «υδάτινο» ως «κατηγορία_οικοσυστήματος», το «θαλάσσιο» ως «τύπος_οικοσυστήματος» και φιλτράρουμε τον «βιότοπο» ως «βαθύ ωκεανό», «θαλάσσιο», «θαλάσσιο ωκεανό», «πελαγικό θαλάσσιο», «θαλάσσιο νερό» , «Ωκεανός», «Θαλασσινό νερό», «Επιφανειακό θαλασσινό νερό», «Επιφανειακό θαλασσινό νερό».Αυτό είχε ως αποτέλεσμα 5903 MAG (734 υψηλής ποιότητας) να διανεμηθούν σε 1823 OTU (προβολές εδώ).
Τα προκαρυωτικά γονιδιώματα σχολιάστηκαν ταξινομικά χρησιμοποιώντας GTDB-Tk (v.1.0.2)64 με προεπιλεγμένες παραμέτρους που στοχεύουν το GTDB r89 έκδοση 13. Το Anvi'o χρησιμοποιήθηκε για την αναγνώριση ευκαρυωτικών γονιδιωμάτων με βάση την πρόβλεψη και την ανάκληση τομέα ≥50% και πλεονασμό ≤%.Ο ταξινομικός σχολιασμός ενός είδους ορίζεται ως ένα από τα αντιπροσωπευτικά του γονιδιώματα.Με εξαίρεση τους ευκαρυώτες (148 MAG), κάθε γονιδίωμα σχολιάστηκε αρχικά λειτουργικά χρησιμοποιώντας prokka (v.1.14.5)65, ονομάζοντας πλήρη γονίδια, ορίζοντας τις παραμέτρους «αρχαία» ή «βακτήρια» όπως απαιτείται, κάτι που αναφέρεται επίσης για μη κωδικοποιώντας γονίδια.και περιοχές CRISPR, μεταξύ άλλων γονιδιωματικών χαρακτηριστικών.Σημειώστε τα προβλεπόμενα γονίδια προσδιορίζοντας καθολικά γονίδια σήμανσης ενός αντιγράφου (uscMG) χρησιμοποιώντας fetchMG (v.1.2)66, εκχωρήστε ομάδες ορθολόγου και αναζητήστε με χρήση emapper (v.2.0.1)67 με βάση το eggNOG (v.5.0)68.Βάση δεδομένων KEGG (δημοσιεύθηκε στις 10 Φεβρουαρίου 2020) 69. Το τελευταίο βήμα πραγματοποιήθηκε αντιστοιχίζοντας πρωτεΐνες στη βάση δεδομένων KEGG χρησιμοποιώντας το DIAMOND (v.0.9.30)70 με κάλυψη ερωτήματος και θέματος ≥70%.Τα αποτελέσματα φιλτραρίστηκαν περαιτέρω σύμφωνα με το NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline71 με βάση το ρυθμό μετάδοσης bit ≥ 50% του μέγιστου αναμενόμενου ρυθμού bit (ο ίδιος ο σύνδεσμος).Αλληλουχίες γονιδίων χρησιμοποιήθηκαν επίσης ως είσοδος για την αναγνώριση BGC στο γονιδίωμα χρησιμοποιώντας antiSMASH (v.5.1.0)72 με προεπιλεγμένες παραμέτρους και διαφορετικές εκρήξεις συστάδων.Όλα τα γονιδιώματα και οι σχολιασμοί έχουν συγκεντρωθεί σε OMD μαζί με μεταδεδομένα με βάση τα συμφραζόμενα διαθέσιμα στον ιστό (https://microbiomics.io/ocean/).
Παρόμοια με τις μεθόδους που περιγράφηκαν προηγουμένως12,22 χρησιμοποιήσαμε CD-HIT (v.4.8.1) για να ομαδοποιήσουμε >56,6 εκατομμύρια γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνη από βακτηριακά και αρχαϊκά γονιδιώματα από OMD σε 95% ταυτότητα και μικρότερα γονίδια (90% κάλυψη)73 έως >17,7 εκατομμύρια συστάδες γονιδίων.Η μακρύτερη αλληλουχία επιλέχθηκε ως αντιπροσωπευτικό γονίδιο για κάθε ομάδα γονιδίων.Στη συνέχεια, τα 1038 μεταγονιδιώματα αντιστοιχίστηκαν σε >17,7 εκατομμύρια μέλη συμπλέγματος BWA (-a) και τα αρχεία BAM που προέκυψαν φιλτράρθηκαν για να διατηρηθούν μόνο ευθυγραμμίσεις με ≥95% τοις εκατό ταυτότητα και ≥45 ευθυγραμμίσεις βάσης.Η αφθονία γονιδίων κανονικοποιημένης μήκους υπολογίστηκε μετρώντας πρώτα τα ένθετα από την καλύτερη μοναδική στοίχιση και, στη συνέχεια, για ασαφώς χαρτογραφημένα ένθετα, προσθέτοντας κλασματικές μετρήσεις στα αντίστοιχα γονίδια-στόχους ανάλογα με τον αριθμό των μοναδικών ενθέτων τους.
Τα γονιδιώματα από το διευρυμένο OMD (με επιπλέον MAG από το "Ca. Eudormicrobiaceae", βλέπε παρακάτω) προστέθηκαν στη βάση δεδομένων εργαλείων μεταγονιδιωματικής ανάλυσης mOTUs74 (v.2.5.1) για να δημιουργηθεί μια εκτεταμένη βάση δεδομένων αναφοράς mOTU.Μόνο έξι γονιδιώματα ενός αντιγράφου (23.528 γονιδιώματα) επέζησαν από δέκα uscMG.Η επέκταση της βάσης δεδομένων είχε ως αποτέλεσμα 4.494 επιπλέον συστάδες σε επίπεδο είδους.1038 μεταγονιδιώματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας προεπιλεγμένες παραμέτρους mOTU (v.2).Συνολικά 989 γονιδιώματα που περιέχονται σε 644 συστάδες mOTU (95% REF, 5% SAG και 99,9% ανήκουν στο MarDB) δεν ανιχνεύθηκαν από το προφίλ mOTU.Αυτό αντανακλά διάφορες πρόσθετες πηγές θαλάσσιας απομόνωσης των γονιδιωμάτων MarDB (τα περισσότερα από τα μη ανιχνευμένα γονιδιώματα σχετίζονται με οργανισμούς που έχουν απομονωθεί από ιζήματα, θαλάσσιους ξενιστές κ.λπ.).Για να συνεχίσουμε να εστιάζουμε στο περιβάλλον ανοιχτού ωκεανού σε αυτήν τη μελέτη, τα αποκλείσαμε από την κατάντη ανάλυση, εκτός εάν εντοπίστηκαν ή συμπεριλήφθηκαν στην εκτεταμένη βάση δεδομένων mOTU που δημιουργήθηκε σε αυτήν τη μελέτη.
Όλα τα BGC από τα MAG, SAG και REF σε OMD (βλ. παραπάνω) συνδυάστηκαν με BGC που προσδιορίστηκαν σε όλα τα μεταγονιδιωματικά ικριώματα (antiSMASH v.5.0, προεπιλεγμένες παράμετροι) και χαρακτηρίστηκαν χρησιμοποιώντας BiG-SLICE (v.1.1) (PFAM domain )75.Με βάση αυτά τα χαρακτηριστικά, υπολογίσαμε όλες τις αποστάσεις συνημιτόνου μεταξύ των BGC και τις ομαδοποιήσαμε (μέσες συνδέσεις) σε GCF και GCC χρησιμοποιώντας κατώφλια απόστασης 0,2 και 0,8 αντίστοιχα.Αυτά τα κατώφλια είναι μια προσαρμογή των ορίων που χρησιμοποιήθηκαν προηγουμένως χρησιμοποιώντας την Ευκλείδεια απόσταση75 μαζί με την απόσταση συνημιτόνου, η οποία μειώνει ένα μέρος του σφάλματος στην αρχική στρατηγική ομαδοποίησης BiG-SLICE (Συμπληρωματικές πληροφορίες).
Στη συνέχεια, τα BGC διηθήθηκαν για να διατηρηθούν μόνο ≥5 kb κωδικοποιημένα σε ικριώματα για να μειωθεί ο κίνδυνος κατακερματισμού όπως περιγράφηκε προηγουμένως16 και για να αποκλειστούν τα MarDB REF και τα SAG που δεν βρέθηκαν σε 1038 μεταγονιδιώματα (βλ. παραπάνω).Αυτό είχε ως αποτέλεσμα συνολικά 39.055 BGC να κωδικοποιηθούν από το γονιδίωμα OMD, με επιπλέον 14.106 να ταυτοποιούνται σε μεταγονιδιωματικά θραύσματα (δηλ. δεν συνδυάζονται σε MAG).Αυτά τα «μεταγονιδιωματικά» BGC χρησιμοποιήθηκαν για την εκτίμηση της αναλογίας του δυναμικού βιοσύνθεσης θαλάσσιου μικροβιώματος που δεν καταγράφηκε στη βάση δεδομένων (Συμπληρωματικές πληροφορίες).Κάθε BGC χαρακτηρίστηκε λειτουργικά σύμφωνα με προγνωστικούς τύπους προϊόντων που ορίζονται από κατηγορίες προϊόντων anti-SMASH ή χονδρότερες κατηγορίες προϊόντων που ορίζονται στο BiG-SCAPE76.Για να αποφευχθεί η ποσοτικοποίηση της μεροληψίας δειγματοληψίας (ταξονομική και λειτουργική σύνθεση GCC/GCF, απόσταση GCF και GCC από βάσεις δεδομένων αναφοράς και μεταγονιδιωματική αφθονία GCF), διατηρώντας μόνο το μεγαλύτερο BGC ανά GCF για κάθε είδος, 39.055 BGCs αφαιρέθηκαν περαιτέρω, με αποτέλεσμα συνολικά 17.689 BGC.
Η καινοτομία του GCC και του GCF αξιολογήθηκε με βάση την απόσταση μεταξύ της υπολογισμένης βάσης δεδομένων (βάση δεδομένων RefSeq στο BiG-FAM)29 και του πειραματικά επαληθευμένου (MIBIG 2.0)30 BGC.Για καθένα από τα 17.689 αντιπροσωπευτικά BGC, επιλέξαμε τη μικρότερη απόσταση συνημιτόνου από την αντίστοιχη βάση δεδομένων.Στη συνέχεια, αυτές οι ελάχιστες αποστάσεις υπολογίζονται κατά μέσο όρο (μέσος όρος) σύμφωνα με το GCF ή το GCC, ανάλογα με την περίπτωση.Ένα GCF θεωρείται νέο εάν η απόσταση από τη βάση δεδομένων είναι μεγαλύτερη από 0,2, που αντιστοιχεί σε έναν ιδανικό διαχωρισμό μεταξύ του (μέσου) GCF και της αναφοράς.Για το GCC, επιλέγουμε το 0,4, το οποίο είναι διπλάσιο από το όριο που ορίζεται από το GCF, για να κλειδώσουμε μια μακροπρόθεσμη σχέση με συνδέσμους.
Η μεταγονιδιωματική αφθονία του BGC υπολογίστηκε ως η μέση αφθονία των βιοσυνθετικών γονιδίων του (όπως προσδιορίζεται από το anti-SMASH) που διατίθενται από προφίλ σε επίπεδο γονιδίου.Η μεταγονιδιωματική αφθονία κάθε GCF ή GCC υπολογίστηκε στη συνέχεια ως το άθροισμα των αντιπροσωπευτικών BGCs (από 17.689).Αυτοί οι χάρτες αφθονίας στη συνέχεια κανονικοποιήθηκαν για την κυτταρική σύνθεση χρησιμοποιώντας την μέτρηση mOTU ανά δείγμα, η οποία επίσης αντιπροσώπευε τις προσπάθειες αλληλουχίας (διευρυμένα δεδομένα, Εικ. 1δ).Ο επιπολασμός του GCF ή του GCC υπολογίστηκε ως το ποσοστό των δειγμάτων με αφθονία > 0.
Η Ευκλείδεια απόσταση μεταξύ των δειγμάτων υπολογίστηκε από το κανονικοποιημένο προφίλ GCF.Αυτές οι αποστάσεις μειώθηκαν σε μέγεθος χρησιμοποιώντας το UMAP77 και οι προκύπτουσες ενσωματώσεις χρησιμοποιήθηκαν για ομαδοποίηση χωρίς επίβλεψη με βάση την πυκνότητα χρησιμοποιώντας HDBSCAN78.Ο βέλτιστος ελάχιστος αριθμός σημείων για ένα σύμπλεγμα (και επομένως ο αριθμός των συστάδων) που χρησιμοποιείται από το HDBSCAN προσδιορίζεται μεγιστοποιώντας τη αθροιστική πιθανότητα ιδιότητας μέλους στο σύμπλεγμα.Οι συστάδες που προσδιορίστηκαν (και ένα τυχαίο ισορροπημένο υποδείγμα αυτών των συστάδων για να ληφθεί υπόψη η μεροληψία στη μεταβλητή πολυμεταβλητή ανάλυση διακύμανσης (PERMANOVA)) δοκιμάστηκαν για σημασία έναντι των μη μειωμένων Ευκλείδειων αποστάσεων χρησιμοποιώντας PERMANOVA.Το μέσο μέγεθος γονιδιώματος των δειγμάτων υπολογίστηκε με βάση τη σχετική αφθονία του mOTU και το εκτιμώμενο μέγεθος γονιδιώματος των μελών των γονιδιωμάτων.Ειδικότερα, το μέσο μέγεθος γονιδιώματος κάθε mOTU υπολογίστηκε ως ο μέσος όρος των μεγεθών γονιδιώματος των μελών του που διορθώθηκε ως προς την πληρότητα (μετά το φιλτράρισμα) (για παράδειγμα, ένα πλήρες γονιδίωμα 75% με μήκος 3 Mb έχει προσαρμοσμένο μέγεθος 4 Mb).για γονιδιώματα μέσου με ακεραιότητα ≥70%.Το μέσο μέγεθος γονιδιώματος για κάθε δείγμα υπολογίστηκε στη συνέχεια ως το άθροισμα των μεγεθών γονιδιώματος mOTU σταθμισμένα με τη σχετική αφθονία.
Ένα φιλτραρισμένο σύνολο BGC με κωδικοποίηση γονιδιώματος στο OMD εμφανίζεται σε βακτηριακά και αρχαϊκά δέντρα GTDB (σε πλαίσια ≥5 kb, εξαιρουμένων των REF και SAG MarDB που δεν βρέθηκαν σε 1038 μεταγονιδιώματα, βλέπε παραπάνω) και τις προβλεπόμενες κατηγορίες προϊόντων τους με βάση τη φυλογενετική θέση του γονιδιώματος (βλ. παραπάνω).Αρχικά μειώσαμε τα δεδομένα ανά είδος, χρησιμοποιώντας ως αντιπροσωπευτικό το γονιδίωμα με τα περισσότερα BGC σε αυτό το είδος.Για οπτικοποίηση, οι εκπρόσωποι χωρίστηκαν περαιτέρω σε ομάδες δέντρων και πάλι, για κάθε κυτταρικό κλάδο, το γονιδίωμα που περιείχε τον μεγαλύτερο αριθμό BGC επιλέχθηκε ως αντιπροσωπευτικό.Είδη εμπλουτισμένα με BGC (τουλάχιστον ένα γονιδίωμα με >15 BGC) αναλύθηκαν περαιτέρω με υπολογισμό του Δείκτη Ποικιλομορφίας Shannon για τους τύπους προϊόντων που κωδικοποιούνται σε αυτά τα BGC.Εάν όλοι οι προβλεπόμενοι τύποι προϊόντων είναι ίδιοι, τα χημικά υβρίδια και άλλα σύνθετα BGCs (όπως προβλέπεται από το anti-SMAH) θεωρείται ότι ανήκουν στον ίδιο τύπο προϊόντος, ανεξάρτητα από τη σειρά τους στο σύμπλεγμα (π.χ. σύντηξη πρωτεΐνης-βακτηριοσίνης και βακτηριοσίνης-πρωτεϊνικής σώμα).υβρίδιο).
Υπολειπόμενο DNA (εκτιμάται ότι είναι 6 ng) από το δείγμα Malaspina MP1648, που αντιστοιχεί στο βιολογικό δείγμα SAMN05421555 και ταιριάζει με το σετ μεταγονιδιωματικής ανάγνωσης Illumina SRR3962772 για σύντομη ανάγνωση, επεξεργασμένο σύμφωνα με το πρωτόκολλο αλληλουχίας PacBio με εξαιρετικά χαμηλή είσοδο δείγματος kSMNA Biobeo για χρήση PacNA κιτ (100-980-000) και κιτ προετοιμασίας προτύπων SMRTbell Express 2.0 (100-938-900).Εν συντομία, το υπόλοιπο DNA κόπηκε, επισκευάστηκε και καθαρίστηκε (σφαιρίδια ProNex) χρησιμοποιώντας Covaris (g-TUBE, 52104).Στη συνέχεια, το καθαρισμένο DNA υποβάλλεται σε προετοιμασία βιβλιοθήκης, ενίσχυση, καθαρισμό (σφαιρίδια ProNex) και επιλογή μεγέθους (>6 kb, Blue Pippin) πριν από ένα τελικό στάδιο καθαρισμού (σφαιρίδια ProNex) και προσδιορισμό αλληλουχίας στην πλατφόρμα Sequel II.
Ανακατασκευή των δύο πρώτων περ.Για το MAG Eremiobacerota, εντοπίσαμε έξι επιπλέον ANIs >99% (αυτά περιλαμβάνονται στο Σχήμα 3), τα οποία αρχικά φιλτραρίστηκαν με βάση τις βαθμολογίες μόλυνσης (αργότερα αναγνωρίστηκαν ως διπλασιασμοί γονιδίων, βλέπε παρακάτω).Βρήκαμε επίσης ένα δίσκο με την ένδειξη "Ca".Eremiobacterota» από διάφορες μελέτες23 και τα χρησιμοποίησε μαζί με οκτώ MAG από τη μελέτη μας ως αναφορά για μεταγονιδιωματικές αναγνώσεις από 633 δείγματα εμπλουτισμένα με ευκαρυωτικά (>0,8 μm) χρησιμοποιώντας BWA (v.0.7.17) Ref -r1188, – σημαία) για υποδειγματοληψία χαρτογράφηση (5 εκατομμύρια αναγνώσεις).Με βάση τους ειδικούς για τον εμπλουτισμό χάρτες (φιλτραρισμένους κατά 95% ταυτότητα ευθυγράμμισης και 80% κάλυψη ανάγνωσης), επιλέχθηκαν 10 μεταγονιδιώματα (αναμενόμενη κάλυψη ≥5×) για συναρμολόγηση και επιπλέον 49 μεταγονιδιώματα (αναμενόμενη κάλυψη ≥1×) για συσχέτιση περιεχομένου.Χρησιμοποιώντας τις ίδιες παραμέτρους όπως παραπάνω, αυτά τα δείγματα δεσμεύτηκαν και προστέθηκαν 10 επιπλέον «Ca».Το MAG Eremiobacerota έχει αποκατασταθεί.Αυτά τα 16 MAG (χωρίς να υπολογίζονται τα δύο ήδη στη βάση δεδομένων) ανεβάζουν τον συνολικό αριθμό γονιδιωμάτων στο διευρυμένο OMD σε 34.815.Τα MAG αποδίδονται ταξινομικές τάξεις με βάση την γονιδιωματική τους ομοιότητα και τη θέση τους στο GTDB.18 MAG αποδιπλασιάστηκαν χρησιμοποιώντας dRep σε 5 είδη (ενδοειδικό ANI >99%) και 3 γένη (ενδογενές ANI 85% έως 94%) εντός της ίδιας οικογένειας79.Οι εκπρόσωποι των ειδών επιλέχθηκαν χειροκίνητα με βάση την ακεραιότητα, τη μόλυνση και το N50.Η προτεινόμενη ονοματολογία παρέχεται στις Συμπληρωματικές Πληροφορίες.
Αξιολογήστε την ακεραιότητα και τη μόλυνση του «Ca.MAG Eremiobacerota, αξιολογήσαμε την παρουσία uscMG, καθώς και σειρές γονιδίων δεικτών ενός αντιγράφου ειδικά για τη γενεαλογία και την περιοχή που χρησιμοποιούνται από τις CheckM και Anvi'o.Η ταυτοποίηση 2 διπλότυπων από τα 40 uscMG επιβεβαιώθηκε με φυλογενετική ανακατασκευή (βλ. παρακάτω) για να αποκλειστεί οποιαδήποτε πιθανή μόλυνση (αυτό αντιστοιχεί σε 5% με βάση αυτά τα 40 γονίδια δεικτών).Μια πρόσθετη μελέτη πέντε αντιπροσωπευτικών MAG «Ca.Το χαμηλό επίπεδο μολυσματικών ουσιών σε αυτά τα ανακατασκευασμένα γονιδιώματα επιβεβαιώθηκε για τα είδη Eremiobacterota χρησιμοποιώντας τη διαδραστική διεπαφή Anvi'o με βάση τους συσχετισμούς αφθονίας και σύνθεσης αλληλουχίας (Συμπληρωματικές πληροφορίες)59.
Για φυλογονιδιωματική ανάλυση, επιλέξαμε πέντε αντιπροσωπευτικά MAG «Ca».Eudormicrobiaceae», όλα τα είδη «Ca.Το γονιδίωμα των Eremiobacterota και μελών άλλων φυλών (συμπεριλαμβανομένων των UBP13, Armatimonadota, Patescibacteria, Dormibacterota, Chloroflexota, Cyanobacteria, Actinobacteria και Planctomycetota) είναι διαθέσιμο από την GTDB (r89)13.Όλα αυτά τα γονιδιώματα σχολιάστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως για την εξαγωγή γονιδίου δείκτη μονού αντιγράφου και τον σχολιασμό BGC.Τα γονιδιώματα GTDB διατηρήθηκαν σύμφωνα με τα παραπάνω κριτήρια ακεραιότητας και μόλυνσης.Η φυλογενετική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τη ροή εργασίας Anvi'o Phylogenetics59.Το δέντρο κατασκευάστηκε χρησιμοποιώντας IQTREE (v.2.0.3) (προεπιλεγμένες επιλογές και -bb 1000)80 σε μια ευθυγράμμιση 39 διαδοχικών ριβοσωμικών πρωτεϊνών που ταυτοποιήθηκαν από τον Anvi'o (MUSCLE, v.3.8.1551)81.Οι θέσεις του μειώθηκαν.για να καλύψει τουλάχιστον το 50% του γονιδιώματος82 και το Planctomycecota χρησιμοποιήθηκε ως εξωομάδα με βάση την τοπολογία δέντρων GTDB.Ένα δέντρο 40 uscMGs κατασκευάστηκε χρησιμοποιώντας τα ίδια εργαλεία και παραμέτρους.
Χρησιμοποιήσαμε το Traitar (v.1.1.2) με προεπιλεγμένες παραμέτρους (φαινότυπος, από νουκλεοτίδια)83 για να προβλέψουμε κοινά μικροβιακά χαρακτηριστικά.Εξερευνήσαμε έναν πιθανό επιθετικό τρόπο ζωής με βάση έναν προηγουμένως αναπτυγμένο αρπακτικό δείκτη84 που εξαρτάται από το περιεχόμενο ενός γονιδίου που κωδικοποιεί πρωτεΐνη στο γονιδίωμα.Συγκεκριμένα, χρησιμοποιούμε το DIAMOND για να συγκρίνουμε πρωτεΐνες στο γονιδίωμα με τη βάση δεδομένων OrthoMCL (v.4)85 χρησιμοποιώντας τις επιλογές –πιο ευαίσθητο –id 25 –query-cover 70 –subject-cover 70 –top 20 ΚΑΙ μετράμε τα γονίδια που αντιστοιχούν σε τα γονίδια-δείκτες για αρπακτικά και μη.Ο δείκτης είναι η διαφορά μεταξύ του αριθμού των αρπακτικών και των μη αρπακτικών σημάνσεων.Ως επιπλέον έλεγχος, αναλύσαμε επίσης το γονιδίωμα «Ca».Ο παράγοντας Entotheonella TSY118 βασίζεται στη συσχέτισή του με το Ca.Eudoremicrobium (μεγάλο μέγεθος γονιδιώματος και βιοσυνθετικό δυναμικό).Στη συνέχεια, δοκιμάσαμε πιθανούς δεσμούς μεταξύ γονιδίων δεικτών αρπακτικών και μη αρπακτικών και το βιοσυνθετικό δυναμικό του Ca.Eudormicrobiaceae» και διαπίστωσε ότι όχι περισσότερα από ένα γονίδια (από οποιονδήποτε τύπο γονιδίου δείκτη, δηλαδή γονίδιο αρπακτικών/μη αρπακτικών) επικαλύπτονται με το BGC, γεγονός που υποδηλώνει ότι το BGC δεν συγχέει τα σήματα θηρευτή.Πραγματοποιήθηκε πρόσθετος γονιδιωματικός σχολιασμός κρυπτογραφημένων αντιγράφων χρησιμοποιώντας το TXSSCAN (v.1.0.2) για να εξεταστεί ειδικά το σύστημα έκκρισης, οι πίλοι και τα μαστίγια86.
Πέντε αντιπροσωπευτικά 'Ca' χαρτογραφήθηκαν με χαρτογράφηση 623 μετατρανγραφωμάτων από τα προκαρυωτικά και ευκαρυωτικά κλάσματα εμπλουτισμού των ωκεανών Tara22,40,87 (χρησιμοποιώντας BWA, v.0.7.17-r1188, -a flag).Γονιδίωμα Eudormicrobiaceae.Τα αρχεία BAM υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με FeatureCounts (v.2.0.1)88 μετά από 80% κάλυψη ανάγνωσης και 95% φιλτράρισμα ταυτότητας (με επιλογές χαρακτηριστικόCounts –κύριο –O –fraction -t CDS,tRNA -F GTF -g ID -p ) Μετρά το αριθμός ενθέτων ανά γονίδιο.Οι δημιουργημένοι χάρτες κανονικοποιήθηκαν για το μήκος γονιδίου και την αφθονία του γονιδίου δείκτη mOTU (μέση μέτρηση εισαγωγής κατά μήκος για γονίδια με αριθμό εισαγωγής >0) και μετασχηματίστηκαν λογαριθμικά σε 22,74 για να ληφθεί η σχετική έκφραση ανά κύτταρο κάθε επιπέδου γονιδίου, το οποίο επίσης εξηγεί μεταβλητότητα από δείγμα σε δείγμα κατά την αλληλουχία.Τέτοιες αναλογίες επιτρέπουν τη συγκριτική ανάλυση, μετριάζοντας τα προβλήματα σύνθεσης όταν χρησιμοποιούνται δεδομένα σχετικής αφθονίας.Μόνο δείγματα με >5 από τα 10 γονίδια δείκτη mOTU εξετάστηκαν για περαιτέρω ανάλυση ώστε να επιτραπεί η ανίχνευση ενός αρκετά μεγάλου τμήματος του γονιδιώματος.
Το κανονικοποιημένο προφίλ μεταγραφής του 'Ca.Το Ε. taraoceanii υποβλήθηκε σε μείωση διαστάσεων χρησιμοποιώντας UMAP και η προκύπτουσα αναπαράσταση χρησιμοποιήθηκε για ομαδοποίηση χωρίς επίβλεψη χρησιμοποιώντας HDBSCAN (βλ. παραπάνω) για τον προσδιορισμό της κατάστασης έκφρασης.Το PERMANOVA ελέγχει τη σημασία των διαφορών μεταξύ των αναγνωρισμένων συστάδων στον αρχικό (όχι μειωμένο) χώρο απόστασης.Η διαφορική έκφραση μεταξύ αυτών των καταστάσεων δοκιμάστηκε σε όλο το γονιδίωμα (βλ. παραπάνω) και 201 μονοπάτια KEGG αναγνωρίστηκαν σε 6 λειτουργικές ομάδες, συγκεκριμένα: BGC, σύστημα έκκρισης και μαστιγιακά γονίδια από TXSSCAN, ένζυμα αποδόμησης (πρωτεάση και πεπτιδάσες) και αρπακτικά και μη αρπακτικά γονίδια.δείκτες αρπακτικών δεικτών.Για κάθε δείγμα, υπολογίσαμε τη διάμεση κανονικοποιημένη έκφραση για κάθε τάξη (σημειώστε ότι η ίδια η έκφραση BGC υπολογίζεται ως η διάμεση έκφραση των βιοσυνθετικών γονιδίων για αυτό το BGC) και δοκιμάσαμε για σημασία σε όλες τις καταστάσεις (δοκιμή Kruskal-Wallis προσαρμοσμένη για FDR).
Τα συνθετικά γονίδια αγοράστηκαν από την GenScript και οι εκκινητές PCR αγοράστηκαν από τη Microsynth.Η πολυμεράση Phusion από την Thermo Fisher Scientific χρησιμοποιήθηκε για την ενίσχυση του DNA.Τα πλασμίδια NucleoSpin, η γέλη NucleoSpin και το κιτ καθαρισμού PCR από την Macherey-Nagel χρησιμοποιήθηκαν για τον καθαρισμό του DNA.Τα περιοριστικά ένζυμα και η Τ4 DNA λιγάση αγοράστηκαν από τη New England Biolabs.Χημικές ουσίες άλλες από ισοπροπυλ-β-d-1-θειογαλακτοπυρανοσίδη (IPTG) (Biosynth) και 1,4-διθειοθρεϊτόλη (DTT, AppliChem) αγοράστηκαν από τη Sigma-Aldrich και χρησιμοποιήθηκαν χωρίς περαιτέρω καθαρισμό.Τα αντιβιοτικά χλωραμφενικόλη (Cm), διυδροχλωρική σπεκτινομυκίνη (Sm), αμπικιλλίνη (Amp), γενταμικίνη (Gt) και καρβενικιλλίνη (Cbn) αγοράστηκαν από την AppliChem.Τα συστατικά μέσων Bacto Tryptone και Bacto Yeast Extract αγοράστηκαν από την BD Biosciences.Η θρυψίνη για αλληλούχιση αγοράστηκε από την Promega.
Οι αλληλουχίες γονιδίων εξήχθησαν από αντι-SMASH προβλεπόμενο BGC 75.1.E. malaspinii (Συμπληρωματικές πληροφορίες).
Τα γονίδια embA (locus, MALA_SAMN05422137_METAG-framework_127-gene_5), embM (locus, MALA_SAMN05422137_METAG-framework_127-gene_4) και embAM (συμπεριλαμβανομένων των διαγονιδιακών περιοχών) συνδυάστηκαν με τη βελτιστοποίηση της αλληλουχίας των περιοχών μεταξύ των γονιδίων (mpA) με τις βελτιστοποιημένες περιοχές (mpU) για έκφραση στο Ε πότε.Το γονίδιο embA υποκλωνοποιήθηκε στην πρώτη θέση πολλαπλής κλωνοποίησης (MCS1) του pACYCDuet-1 (CmR) και του pCDFDuet-1 (SmR) με θέσεις διάσπασης BamHI και HindIII.Τα γονίδια embM και embMopt (βελτιστοποιημένα με κωδικόνιο) υποκλωνοποιήθηκαν σε MCS1 pCDFDuet-1 (SmR) με BamHI και HindIII και τοποθετήθηκαν στη δεύτερη θέση πολλαπλής κλωνοποίησης των pCDFDuet-1 (SmR) και pRSFDuet-1 (KanR) (MCS2) με NdeI/ChoI.Η κασέτα embAM υποκλωνοποιήθηκε σε pCDFDuet1 (SmR) με θέσεις διάσπασης BamHI και HindIII.Το γονίδιο orf3/embI (τόπος, MALA_SAMN05422137_METAG-scaffold_127-gene_3) κατασκευάστηκε με PCR επέκτασης επικάλυψης χρησιμοποιώντας εκκινητές EmbI_OE_F_NdeI και EmbI_OE_R_XhoI, χωνεμένες με NdeI και FMCHOI χρησιμοποιώντας NdeI/Dliget-MchoI ίδια ένζυμα περιορισμού (Συμπληρωματικό τραπέζι).6).Η πέψη και η απολίνωση με ένζυμα περιορισμού πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (New England Biolabs).