Χημικό συστατικό σωλήνων 310 10*1 mm από ανοξείδωτο χάλυβα, οι Ν-τερματικές περιοχές της spidroin σχηματίζουν υδρογέλες που βασίζονται σε ινίδια αμυλοειδούς και παρέχουν μια πλατφόρμα για ακινητοποίηση πρωτεϊνών.

Σας ευχαριστούμε που επισκεφτήκατε το Nature.com.Χρησιμοποιείτε μια έκδοση προγράμματος περιήγησης με περιορισμένη υποστήριξη CSS.Για την καλύτερη εμπειρία, συνιστούμε να χρησιμοποιήσετε ένα ενημερωμένο πρόγραμμα περιήγησης (ή να απενεργοποιήσετε τη λειτουργία συμβατότητας στον Internet Explorer).Επιπλέον, για να διασφαλίσουμε τη συνεχή υποστήριξη, εμφανίζουμε τον ιστότοπο χωρίς στυλ και JavaScript.
Ρυθμιστικά που εμφανίζουν τρία άρθρα ανά διαφάνεια.Χρησιμοποιήστε τα κουμπιά πίσω και επόμενο για να μετακινηθείτε στις διαφάνειες ή τα κουμπιά του ελεγκτή ολίσθησης στο τέλος για να μετακινηθείτε σε κάθε διαφάνεια.

Προσδιορισμός

310 Προμηθευτές σωληνώσεων 10*1mm από ανοξείδωτο χάλυβα

Χημική σύνθεση

Μηχανικές ιδιότητες

Οι ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες μεταξιού αράχνης (πρωτεΐνες μεταξιού αράχνης) έχουν πολλές πιθανές εφαρμογές στην ανάπτυξη νέων βιοϋλικών, αλλά η πολυτροπική και επιρρεπής σε συσσωμάτωση φύση τους καθιστά δύσκολη την απόκτηση και εύκολη χρήση.Εδώ αναφέρουμε ότι οι ανασυνδυασμένες μικροσκοπικές πρωτεΐνες spidroin και, σημαντικότερα, η ίδια η Ν-τερματική περιοχή (NT) σχηματίζουν γρήγορα αυτοφερόμενες και διαφανείς υδρογέλες στους 37 °C.πρωτεΐνες σύντηξης που αποτελούνται από NT και πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη ή νουκλεοσιδική φωσφορυλάση πουρίνης σχηματίζουν πλήρως λειτουργικές πρωτεΐνες σύντηξης.Υδροπηκτές.Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι οι ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες ΝΤ και σύντηξης παρέχουν υψηλές αποδόσεις έκφρασης και προσδίδουν στις υδρογέλες ελκυστικές ιδιότητες όπως διαφάνεια, ζελατινοποίηση χωρίς σταυροσύνδεση και άμεση ακινητοποίηση ενεργών πρωτεϊνών σε υψηλή πυκνότητα.
Οι αράχνες έχουν έως και επτά διαφορετικά σετ αδένων μεταξιού, καθένα από τα οποία παράγει έναν συγκεκριμένο τύπο μεταξιού.Και τα επτά είδη μεταξιού αποτελούνται από πρωτεΐνες μεταξιού αράχνης (σπινδροΐνες) μήκους περίπου 6000 υπολειμμάτων και περιέχουν μια μεγάλη κεντρική επαναλαμβανόμενη περιοχή που περιβάλλεται από σφαιρικούς Ν- και Ο-τελικούς τομείς (NT και CT)1,2.Ο πιο ευρέως μελετημένος τύπος μεταξιού, η πρωτογενής αμπούλα, παράγεται από τον πρωτογενή αδένα της αμπούλας.Σε αυτόν τον αδένα, μια μονοστοιβάδα επιθηλιακών κυττάρων συνθέτει πρωτεΐνες spidroin και τις εκκρίνει στον αυλό του αδένα, όπου υπάρχουν σε διαλυτή μορφή (ντόπινγκ) σε εξαιρετικά υψηλές συγκεντρώσεις (30–50% w/v)3,4.Η οργάνωση και η διαμόρφωση των κύριων πρωτεϊνών της σπινδροΐνης της αμπούλας στον αδένα έχει συζητηθεί, αλλά τα περισσότερα πειραματικά στοιχεία υποδεικνύουν την παρουσία μιας γενικά ελικοειδούς ή/και τυχαίας ελικοειδής διαμόρφωσης και μικκυλιακών ή ελασματοειδών δομών5,6,7,8,9,10.Ενώ οι επαναλαμβανόμενες περιοχές ρυθμίζουν τις μηχανικές ιδιότητες των ινών μεταξιού, σχηματίζοντας νανοκρυστάλλους β-φύλλων και άμορφες δομές11,12,13,14,15, οι τελικές περιοχές ρυθμίζουν τις ίνες μεταξιού ως απόκριση στις μεταβαλλόμενες συνθήκες κατά μήκος του αδένα του μεταξιού16,17,18.Με τον έλεγχο του σχηματισμού μεταξιού, 19. Οι τερματικοί τομείς διατηρούνται εξελικτικά και η λειτουργία τους μπορεί να είναι κοινή σε όλες τις πρωτεΐνες spidroin 2,20,21.Κατά τη διέλευση από τον αδένα, το pH της σπινδροΐνης μειώνεται από περίπου 7,6 σε < 5,716 και αυξάνεται με τη διάτμηση και το τέντωμα που προκαλείται από κίνηση μέσω του σταδιακά στενευόμενου αγωγού.Σε διάλυμα, το CT είναι ένα α-ελικοειδές συστατικό παράλληλο διμερές17, αλλά ως απόκριση στο χαμηλό pH και τις δυνάμεις διάτμησης, το CT ξεδιπλώνεται και διακόπτει τα β-στρώματα16, 17, πυροδοτώντας πιθανώς τα β-στρώματα στις επαναλαμβανόμενες περιοχές του Convert 16. Τα NT είναι μονομερή υπό συνθήκες που αντανακλούν συνθήκες στον αυλό του αδένα και μεσολαβούν στη διαλυτότητα της σπινδροΐνης, αλλά σε μειωμένο pH, η πρωτονίωση ενός αριθμού πλευρικών αλυσίδων καρβοξυλικού οξέος οδηγεί σε διμερισμό του NT με pKa περίπου 6,5, σταθεροποιώντας έτσι το NT και σταθεροποιώντας το spidroin σε μεγάλες ποσότητες.δίκτυα 16,18.Έτσι, το NT παίζει βασικό ρόλο στο σχηματισμό νήματος, αλλάζοντας από μονομερές στην επικάλυψη σε διμερές στην ίνα23,24,25.Το NT παραμένει εξαιρετικά διαλυτό και ελικοειδές υπό όλες τις συνθήκες που έχουν μελετηθεί μέχρι σήμερα16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29, γεγονός που ενέπνευσε την ανάπτυξή του ως ετικέτα ενίσχυσης της διαλυτότητας για την παραγωγή ετερόλογων πρωτεϊνών.
Η ανασυνδυασμένη μίνι πρωτεΐνη μεταξιού αράχνης, που αποτελείται από ένα NT, μια μικρή περιοχή επανάληψης, ένα CT και μια ετικέτα His6 (His-NT2RepCT) για καθαρισμό, είναι τόσο διαλυτή σε υδατικό ρυθμιστικό διάλυμα όσο η φυσική πρωτεΐνη μεταξιού αράχνης και μιμείται εγγενή σημαντικά χαρακτηριστικά της αράχνης μεταξιού .κάλυψη 25,31.Το His-NT2RepCT μπορεί να περιδινηθεί σε συνεχείς ίνες χρησιμοποιώντας μια βιομιμητική μηχανή στην οποία μια διαλυτή επίστρωση με pH 8 εξωθείται σε ένα λουτρό νερού με pH 525,32,33,34,35.Η ζύμωση με βιοαντιδραστήρα του Ε. coli που εκφράζει το His-NT2RepCT και η επακόλουθη μετα-κατεργασία οδήγησε σε απόδοση >14 g/L μετά τον καθαρισμό.Η υψηλή απόδοση, η υψηλή διαλυτότητα και η επαρκής απόκριση του His-NT2RepCT σε όξινες συνθήκες αποδίδονται όλα στα NT23, 25, 34.
Εδώ αναφέρουμε τον γρήγορο σχηματισμό διαφανών υδρογέλης από ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες spidroin, συμπεριλαμβανομένου του NT μόνο, με επώαση ενός διαλύματος πρωτεΐνης στους 37 °C.Χρησιμοποιώντας φθορισμό θειοφλαβίνης Τ (ThT), φασματοσκοπία υπέρυθρου μετασχηματισμού Fourier (FTIR), φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR) και ηλεκτρονική μικροσκοπία μετάδοσης (TEM), βρήκαμε ότι οι πρωτεΐνες NT και μικροαράχνης υφίστανται δομικό μετασχηματισμό σε β-φύλλα και ινίδια που μοιάζουν με αμυλοειδές όταν σχηματίζονται γέλες.Επιπλέον, πρωτεΐνες σύντηξης NT και πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης (GFP) ή νουκλεοσιδικής φωσφορυλάσης πουρίνης (PNP) σχηματίζουν υδρογέλες με πλήρως λειτουργικά θραύσματα σύντηξης.Η έκφραση υψηλής απόδοσης σε ετερόλογους ξενιστές, σε συνδυασμό με τον γρήγορο σχηματισμό υδρογελών υπό φυσιολογικές συνθήκες, ανοίγει τη δυνατότητα οικονομικής παραγωγής υδρογέλης με μηχανικές λειτουργίες.
Σε αντίθεση με τις περισσότερες αναφερόμενες ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες spidroin36, το His-NT2RepCT είναι σταθερό σε ρυθμιστικό διάλυμα Tris-HCl σε pH 8 και μπορεί να συγκεντρωθεί έως και 500 mg/mL χωρίς καθίζηση25.Επομένως, με έκπληξη ανακαλύψαμε ότι αυτή η πρωτεΐνη σχηματίζει γρήγορα οπτικά διαυγείς, αυτοφερόμενες υδρογέλες όταν επωάζεται στους 37°C (Εικ. 1b-d).Περαιτέρω μελέτες έδειξαν ότι η ζελατινοποίηση His-NT2RepCT συνέβη σε ένα ευρύ φάσμα συγκεντρώσεων πρωτεΐνης (10–300 mg/mL) και ότι αυτή η συγκέντρωση συσχετίστηκε αντιστρόφως με το χρόνο ζελατινοποίησης (Εικ. 1γ και Συμπληρωματικό Σχήμα 1).Για να μάθουμε ποια μέρη του His-NT2RepCT μεσολαβούν στο σχηματισμό υδρογέλης, στη συνέχεια εξετάσαμε κάθε τομέα ξεχωριστά και σε διάφορους συνδυασμούς χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία αναστροφής φιάλης (Εικόνα 1a,b).Όλα τα ελεγμένα κλάσματα της ανασυνδυασμένης σπινδροΐνης σχημάτισαν γέλες (σε συγκέντρωση πρωτεΐνης 300 mg/mL) σε λιγότερο από 1 ώρα, εκτός από την καταβυθισμένη 2Rep (Εικ. 1β).Αυτό υποδηλώνει ότι η NT και η CT μόνα τους, σε συνδυασμό ή σε συνδυασμό με επαναλήψεις, μπορούν να πήξουν στους 37°C και ότι η ετικέτα His6 δεν επηρεάζει αυτή τη διαδικασία σε σημαντικό βαθμό.Δεδομένης της κοινής αντίληψης ότι το NT είναι μια εξαιρετικά διαλυτή και σταθερή πρωτεΐνη και ότι προηγούμενες αναφορές για ανασυνδυασμένες υδρογέλες spidroin έχουν αποδώσει αποτελέσματα ζελατινοποίησης σε αλλαγές διαμόρφωσης σε επαναλαμβανόμενες περιοχές ή/και CT, η ίδια η NT θα μπορούσε.Η ανακάλυψη της ζελατινοποίησης ήταν απροσδόκητη.Συμπληρωματικός Πίνακας 1) 37, 38, 39. Αξιοσημείωτα, το ΝΤ έχει ήδη πηκτωματοποιηθεί εντός 10 λεπτών σε συγκέντρωση ≥ 300 mg/mL (Εικ. 1c).Πειράματα αναστροφής φιαλιδίου με διάφορες συγκεντρώσεις ΝΤ έδειξαν ότι σε >50 mg/mL το διάλυμα ΝΤ πηκτωματοποιήθηκε ταχύτερα από το His-NT2RepCT στην αντίστοιχη συγκέντρωση (w/v, Σχήμα 1c).
Σχηματική αναπαράσταση διαφόρων κατασκευών spidroin που μελετήθηκαν σε αυτή την εργασία.b Χρόνος γέλης στους 37 °C για διάφορες ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες spidroin (300 mg/mL) επαληθεύτηκε με αναστροφή του φιαλιδίου.Γέλη CT αμέσως χωρίς επώαση (<300 mg/mL), ιζήματα 2Rep (300 mg/mL, κλίμακα 5 mm).c Χρόνος γέλης His-NT2RepCT και NT σε ενδεικνυόμενες συγκεντρώσεις πρωτεΐνης στους 37°C.d Φωτογραφίες των υδρογέλης His-NT2RepCT και NT με την αράχνη και το γράμμα «NT» τυπωμένα από κάτω, αντίστοιχα (και τα δύο 200 mg/mL, ράβδος κλίμακας 5 mm).
Οι υδρογέλες που σχηματίζονται από διάφορες ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες spidroin έχουν ελαφρώς διαφορετικά χρώματα και η παρατήρηση με γυμνό μάτι δείχνει διάφορους βαθμούς διαφάνειας (Εικ. 1β).Τα πηκτώματα NT είναι εξαιρετικά διαυγή ενώ άλλα τζελ γίνονται αδιαφανή.Τα πηκτώματα His-NT2RepCT και NT που χύνονται σε κυλινδρικούς σωλήνες θα μπορούσαν να αφαιρεθούν από το καλούπι ανέπαφα (Εικ. 1δ).
Για να ελεγχθεί εάν η φυσική γέλη επικαλύψεων από μετάξι αράχνης υπό συνθήκες που τώρα βρέθηκε ότι προκαλούν ζελατινοποίηση των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών spidroin, συλλέχθηκαν επικαλύψεις από τον μεγάλο αδένα αμπούλας της σουηδικής αράχνης γέφυρας (Larinioides sclopetarius).Οι επικαλύψεις αποθηκεύτηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα Tris-HCl 20 mM στα 50 mg/mL (με βάση το μετρημένο ξηρό βάρος), αλλά δεν παρατηρήθηκε ζελατινοποίηση κατά τη διάρκεια της επώασης 21 ημερών στους 37 °C (Συμπληρωματικό Σχήμα 2a).
Για τον ποσοτικό προσδιορισμό αυτών των πηκτωμάτων, μπορούν να χρησιμοποιηθούν ρεολογικές μετρήσεις για τη μελέτη της διαδικασίας ζελατινοποίησης και τον προσδιορισμό των συνολικών μηχανικών ιδιοτήτων.Συγκεκριμένα, η παρακολούθηση του συντελεστή αποθήκευσης (ελαστικότητα) σε υψηλές θερμοκρασίες μπορεί να παρέχει πληροφορίες για τη θερμοκρασία πηκτωματοποίησης καθώς και για τις ιξωδοελαστικές ιδιότητες της επικάλυψης.Πειράματα αύξησης θερμοκρασίας (χρησιμοποιώντας 1°C/min στους 25-45°C, με βάση προηγούμενες μελέτες που χρησιμοποιούν διαλύματα φυσικού μεταξιού)40,41 έδειξαν ότι οι συντελεστές αποθήκευσης των διαλυμάτων His-NT2RepCT και NT αυξάνονταν με την αύξηση της θερμοκρασίας.αυξήθηκε (Εικ. 2 και Συμπληρωματικό Σχ. 3).Συγκεκριμένα, η μονάδα NT άρχισε να αναπτύσσεται σε χαμηλότερη θερμοκρασία σε σύγκριση με το His-NT2RepCT, σύμφωνα με τον ταχύτερο χρόνο γέλης που παρατηρήθηκε όταν το NT επωάστηκε απευθείας με το His-NT2RepCT στους 37°C (Εικόνα 1).Μετά από μια επακόλουθη πτώση της θερμοκρασίας, ο συντελεστής αποθήκευσης δεν επέστρεψε σε χαμηλότερες τιμές και παρέμεινε πάνω από τον συντελεστή απώλειας (βλ. Συμπληρωματικό Σχ. 3), υποδεικνύοντας θερμικά μη αναστρέψιμη σταθερή ζελατινοποίηση.Μετά τη ζελατινοποίηση, ο τελικός συντελεστής ελαστικότητας κυμαινόταν από 15 έως 330 kPa για τις υδρογέλες His-NT2RepCT σε συγκέντρωση 100–500 mg/mL και ο τελικός συντελεστής ελαστικότητας για τις υδρογέλες NT (100–500 mg/mL) κυμαινόταν από 2 έως 1400 kPa (Εικ. , 2 και πλήρη δεδομένα ράμπας) βλέπε Συμπληρωματικό Σχ. 3).
a Αλλαγή στη θερμοκρασία κατά τις μετρήσεις του His-NT2RepCT (300 mg/mL) και του b NT (300 mg/mL) με ανακίνηση.Τα βέλη υποδεικνύουν την τάση θερμοκρασίας και η ελαφρύτερη σκίαση των δεδομένων της μονάδας αποθήκευσης απεικονίζει τη δοκιμή σε χαμηλότερες τιμές ροπής για το όργανο από αυτές που καθορίζονται από τον κατασκευαστή, γεγονός που είναι η αιτία του αυξημένου θορύβου.γ Συσσώρευση τελικής μονάδας His-NT2RepCT και NT μετά από αυξημένη θερμοκρασία (100, 300 και 500 mg/mL).Όλες οι μετρήσεις της μονάδας λαμβάνονται σε συχνότητα 0,1 Hz.
Ως πιθανή μέθοδος για τη διερεύνηση των αλλαγών διαμόρφωσης που σχετίζονται με τη ζελατινοποίηση, καταγράψαμε τα φάσματα FTIR των His-NT2RepCT και NT πριν και μετά τη ζελατινοποίηση στους 37°C (Εικόνα 3a,b).Όπως αναμενόταν, τα φάσματα των διαλυμάτων His-NT2RepCT και NT αντιστοιχούσαν σε πρωτεΐνες που εμφανίζουν δευτερεύουσα δομή α-έλικας/τυχαίας σπείρας, με έντονη ζώνη στα 1645 cm-1.Και για τις δύο υδρογέλες, η ζελατινοποίηση οδήγησε στον σχηματισμό δύο βραχιόνων στη μεσαία ζώνη Ι σε περίπου 1617 cm-1 και 1695 cm-1 (Εικ. 3a, b), υποδεικνύοντας το σχηματισμό αντιπαράλληλων δομών β-φύλλων.Αυτές οι αλλαγές μπορούν επίσης να φανούν καθαρά στα αντίστοιχα φάσματα γέλης δεύτερου παραγώγου και διαφοράς (Συμπληρωματικό Σχήμα 4β).Οι δύο ζώνες της στιβάδας β ΝΤ ήταν πιο έντονες από αυτές του His-NT2RepCT, υποδεικνύοντας ότι το συνολικό περιεχόμενο των ζωνών β-στιβάδων στην υδρογέλη ΝΤ ήταν υψηλότερο από αυτό της υδρογέλης NT2RepCT.
ένα φάσματα απορρόφησης FTIR του His-NT2RepCT και b NT (και τα δύο 500 mg/mL) πριν από (διάλυμα) και μετά (γέλη) επώαση στους 37°C.c Εικόνες TEM επαναιωρημένων πηκτωμάτων NT2RepCT 50 mg/ml και d NT.Γραμμή κλίμακας 200 nm.e Διάμετροι ινών υδρογέλης His-NT2RepCT και NT.n = 100 μετρημένα ινίδια, ρ < 0,0001.Οι γραμμές σφάλματος δείχνουν την τυπική απόκλιση.Το κέντρο των ράβδων σφάλματος είναι ο μέσος όρος.Για στατιστική ανάλυση χρησιμοποιήθηκε ένα μη ζευγαρωμένο t-test (two-tailed).f ThT φθορισμός διαφόρων ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών spidroin (100 mg/mL) στους 37 °C χωρίς ανακίνηση.g NT (100 mg/mL) πειράματα εμβολιασμού από 100 mg/mL γέλη NT με 0%, 5%, 10% και 20% σπόρους.
Η ανάλυση της γέλης χρησιμοποιώντας ηλεκτρονικό μικροσκόπιο μετάδοσης (TEM) έδειξε ότι η υδρογέλη αποτελείται από ινίδια που μοιάζουν με αμυλοειδές (Εικ. 3c, 3d).Τα ινίδια που σχηματίστηκαν από NT ήταν επιμήκη (διάμετρος 5-12 nm) και μη διακλαδισμένα, ενώ τα ινίδια His-NT2RepCT ήταν μικρότερα σε μήκος και σημαντικά ευρύτερα σε διάμετρο (7-16 nm) (Εικ. 3e).Αυτά τα αποτελέσματα μας επέτρεψαν να παρακολουθήσουμε την κινητική της ίνωσης χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία θειοφλαβίνης Τ (ThT).Για όλες τις ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες spidroin, το σήμα φθορισμού αυξήθηκε όταν τα δείγματα επωάστηκαν στους 37 °C (Εικ. 3f, Συμπληρωματικό Σχήμα 5a).Σε συμφωνία με αυτό το εύρημα, η μικροσκοπική εξέταση του NT και του His-NT2RepCT υπό συνθήκες πηκτωματοποίησης αποκάλυψε ομοιόμορφη αύξηση στον φθορισμό ThT χωρίς αξιοσημείωτη τοπική συσσώρευση ThT-θετικών συσσωματωμάτων (Συμπληρωματικό Σχήμα 5b,c).Ο σχηματισμός ThT-θετικών ινιδίων δεν συνοδεύτηκε από αύξηση της θολότητας NT και His-NTCT (Συμπληρωματικό Σχήμα 5d), που σημαίνει ότι ένα δίκτυο ινιδίων στο πήκτωμα θα μπορούσε να σχηματιστεί χωρίς να διακυβεύεται η διαύγεια της γέλης.Η σπορά με την προσθήκη μικρών ποσοτήτων προσχηματισμένων ινιδίων μπορεί να επιταχύνει σημαντικά τον σχηματισμό ινιδίων ορισμένων αμυλοειδών42,43,44 αλλά προσθέτοντας 5%, 10% ή 20% (w/w) NT σε ένα διάλυμα ΝΤ υδροθρομβωτικών.αποτέλεσμα σποράς (Εικ. 3g).Ίσως αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι τα ινίδια στην υδρογέλη είναι σχετικά σταθερά και δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως σπόροι.
Η απροσδόκητη συμπεριφορά των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών spidroin σε υψηλές θερμοκρασίες ώθησε περαιτέρω μελέτες φασματοσκοπίας πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR) για τον εντοπισμό διαμορφωτικών αλλαγών που σχετίζονται με το σχηματισμό γέλης.Τα φάσματα NMR των διαλυμάτων His-NT2RepCT που καταγράφηκαν με την πάροδο του χρόνου στους 37°C έδειξαν ότι η CT ήταν ακόμη εν μέρει αναδιπλωμένη, ενώ τα σήματα NT και 2Rep είχαν εξαφανιστεί (Εικ. 4a), υποδηλώνοντας ότι ήταν κυρίως NT και 2Rep αυτός ο μερικώς ελεγχόμενος σχηματισμός His- Υδρογέλη NT2RepCT.Το σήμα CT μειώθηκε επίσης στο 20% της αρχικής του έντασης, υποδηλώνοντας ότι το CT είναι επίσης ως επί το πλείστον σταθερό και ενσωματωμένο στη δομή υδρογέλης.Για ένα μικρότερο τμήμα του CT, το οποίο είναι τόσο κινητό όσο στο προεπωασμένο δείγμα και επομένως παρατηρείται με NMR διαλύματος, τα φάσματα στερούνται σημάτων για τα πρώτα 10 δομημένα υπολείμματα, πιθανώς λόγω δύσκολης ακινητοποίησης του προσαρτημένου τμήματος του His-NT2Rep.Τα φάσματα NMR της -κατάστασης των υδροπηκτωμάτων -NT2RepCT αποκάλυψαν την κυρίαρχη παρουσία α-ελίκων και β-στιβάδων και, σε μικρότερο βαθμό, τη διαμόρφωση τυχαίας σπείρας (Εικ. 4β).Η ανάλυση χημικής μετατόπισης των υπολειμμάτων μεθειονίνης που υπάρχουν μόνο στη ΝΤ έδειξε ότι αυτή η περιοχή είχε μετατραπεί σε δομή β-φύλλου.Τα εξαρτώμενα από τον χρόνο φάσματα του ΝΤ στο διάλυμα έδειξαν ομοιόμορφη μείωση στην ένταση του σήματος (Εικ. 4c) και το NMR στερεάς κατάστασης των υδρογέλης ΝΤ έδειξε ότι τα περισσότερα από τα υπολείμματα ΝΤ μετατράπηκαν σε δομές β-φύλλων (Εικ. 4d).Η διαμόρφωση του 2Rep δεν μπορούσε να προσδιοριστεί ξεχωριστά λόγω της τάσης του να συγκεντρώνεται.Ωστόσο, τα φάσματα NMR στερεάς κατάστασης των υδρογέλης NTCT και His-NT2RepCT έμοιαζαν πολύ (Εικ. 4b, Συμπληρωματικό Σχ. 6β), υποδηλώνοντας ότι το 2Rep συνεισέφερε ελάχιστα στο δομικό μέρος της υδρογέλης His-NT2RepCT.Για υδρογέλες CT, βρέθηκαν α-έλικες, β-φύλλα και τυχαίες ελικοειδείς δευτερεύουσες δομές (Συμπληρωματικό Σχήμα 6δ).Αυτό υποδηλώνει ότι ορισμένα μέρη του CT παραμένουν α-έλικες ενώ άλλα γίνονται β-φύλλα.Έτσι, τα αποτελέσματα της φασματοσκοπίας NMR υποδηλώνουν ότι το NT είναι σημαντικό για το σχηματισμό υδρογέλης και επίσης μετασχηματίζεται σε μια διαμόρφωση β-φύλλου κατά τη σύντηξη με 2Rep και CT.Σύμφωνα με αυτό, ανακαλύψαμε πρόσφατα ότι πιθανώς σχηματίζονται αμυλοειδείς χωρικές φερμουάρ και στις πέντε έλικες του τομέα NT και ο αλγόριθμος Waltz προέβλεψε μια αμυλοειδογόνο περιοχή στην έλικα 1 (Εικ. 4e).
Φάσματα 2D διαλύματος 15N-HSQC 10 mg/mL His-NT2RepCT πριν (μπλε) και 19 ώρες μετά την επώαση (κόκκινο) στους 37°C.Οι επιμέρους εγκάρσιες κορυφές στο κόκκινο φάσμα και οι F24, G136, polyA στο μπλε φάσμα σημειώνονται με σύμβολα αμινοξέων και αριθμούς υπολειμμάτων ενός γράμματος.Τα ένθετα δείχνουν την εξάρτηση της έντασης του σήματος από τον χρόνο για επιλεγμένα υπολείμματα από τους τομείς NT, 2Rep και CT.β Φάσματα ραδιοσυχνοτήτων στερεάς κατάστασης (RFDR) υδρογέλης His-NT2RepCT.Οι συσχετίσεις των υπολειμμάτων Ca/Cβ που παρατηρήθηκαν στα φάσματα RFDR προσδιορίστηκαν με σύγκριση με τις χημικές μετατοπίσεις του μοντέλου πεπτιδίου και τις τιμές που προέρχονται από στατιστικά στοιχεία82,83 και τις δευτερεύουσες δομές τους.SSB – περιστρεφόμενη πλευρική ζώνη.γ Μονοδιάστατα φάσματα διαλύματος 15N-HSQC 10 mg/mL NT κατά τη διάρκεια της επώασης στους 37 °C για 36 ώρες.Το ένθετο δείχνει την ογκομετρική ένταση σε σχέση με το χρόνο.d Φάσματα RFDR στερεάς κατάστασης υδρογέλης ΝΤ.Υποδεικνύονται οι συσχετισμοί των υπολειμμάτων Ca/Cβ και οι δευτερογενείς δομές τους που παρατηρούνται στα φάσματα RFDR.e Βασίζεται στο προφίλ τάσης μαρμαρυγής NT45.79 από τη βάση δεδομένων Zipper (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/).Η ενέργεια Rosetta του χωρικού παραθύρου μετατόπισης κεραυνού του εξαπεπτιδίου εμφανίζεται σε kcal/mol.Οι κόκκινες ράβδοι υποδηλώνουν εξαπεπτίδια με υψηλή τάση ίνωσης (ενέργεια Rosetta κάτω από -23 kcal/mol, κάτω από τη διακεκομμένη γραμμή).Οι πράσινες ράβδοι υποδεικνύουν θραύσματα με ενέργειες Rosetta πάνω από το κατώφλι και επομένως είναι λιγότερο πιθανό να σχηματίσουν στερικά φερμουάρ.Τα θραύσματα που περιείχαν προλίνη εξαιρέθηκαν από την ανάλυση (χωρίς στήλες).Τα τετράγωνα υποδεικνύουν περιοχές αμυλοείδωσης που προβλέπονται από τον αλγόριθμο Waltz81 (https://waltz.switchlab.org).Η αλληλουχία των υπολειμμάτων αμινοξέων του NT βρίσκεται στην κορυφή και οι τύποι υπολειμμάτων που βρίσκονται στη δευτερογενή δομή β (που προσδιορίζονται με φασματοσκοπία NMR στερεάς κατάστασης) φαίνονται με κόκκινο χρώμα.Οι θέσεις των πέντε α-έλικων ΝΤ ορίζονται ως (Η1-Η5)28.
Σε pH <6,5, το HT διμερίζεται, όντας ανθεκτικό στη μετουσίωση που προκαλείται από τη θερμότητα ή την ουρία18.Για να αποσαφηνιστεί πώς ο διμερισμός και η σταθερότητα του ΝΤ επηρεάζουν τη ζελατινοποίηση, τα διαλύματα που περιείχαν 100 mg/ml NT ελέγχθηκαν σε pH 8, 7 και 6 χρησιμοποιώντας τη δοκιμή αναστροφής φιαλιδίου.Τα δείγματα ΝΤ επωάστηκαν σε ρΗ 8 και 7 πηκτωματοποιήθηκαν μετά από 30 λεπτά στους 37 °C, αλλά η γέλη με ρΗ 8 παρέμεινε διαυγής, ενώ η γέλη με ρΗ 7 έδειξε ένα ορατό ίζημα (Εικ. 5α).Αντίθετα, ένα διάλυμα που περιέχει ΗΤ σε ρΗ 6 δεν σχημάτισε γέλη και ένα μεγάλο ίζημα μπορούσε να φανεί μετά από 20 λεπτά στους 37°C.Αυτό υποδηλώνει ότι τα ίδια τα διμερή και/ή η υψηλότερη σταθερότητά τους σε σύγκριση με τα μονομερή αποτρέπουν τη ζελατινοποίηση.Ο σχηματισμός ιζήματος για NT σε pH 7 και 6 δεν αναμενόταν, καθώς έχει αναφερθεί ότι το NT είναι διαλυτό στα 200 mg/ml27, αναδιπλώνεται εύκολα μετά τη θερμική μετουσίωση και επίσης διατηρεί μια α-έλικα σε χαμηλότερες τιμές pH 18. Μια πιθανή εξήγηση για αυτές τις αποκλίσεις είναι ότι τα πειράματα που αναφέρθηκαν προηγουμένως πραγματοποιήθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου ή χαμηλότερη, ή σε σχετικά χαμηλές συγκεντρώσεις πρωτεΐνης16,18,19.
Δοκιμή αναστροφής φιαλιδίου NT (100 mg/mL) σε ρΗ 8, 7, 6 και 154 mM NaCl (ρΗ 8) μετά από επώαση στους 37°C.b Φάσματα NT CD με και χωρίς 154 mM NaF και 154 mM NaCl, αντίστοιχα.Η μοριακή ελλειπτικότητα στα 222 nm μετατρέπεται σε αναλογία φυσικών πτυχών.c Δοκιμασία αναστροφής NT (100 mg/mL) NT* (37 °C και 60 °C), NTA72R (37 °C) και His-NT-L6 (37 °C και 60 °C).d Φάσματα CD των μεταλλαγμάτων ΝΤ NT*, NTA72R και His-NT-L6.Η μοριακή ελλειπτικότητα στα 222 nm μετατρέπεται σε αναλογία φυσικών πτυχών.e Δοκιμή αναστροφής NTFlSp, NTMiSp και μειωμένου NTMiSp (100 mg/mL).Μπάρα ζυγαριάς 5 mm.f Φάσματα CD NT, NTFlSp, NTMiSp και μειωμένου NTMiSp.Η μοριακή ελλειπτικότητα στα 222 nm μετατρέπεται σε αναλογία φυσικών πτυχών.Τα πλήρη φάσματα NT στους 25 °C και 95 °C φαίνονται στο συμπληρωματικό σχήμα 8.
Η φυσιολογική συγκέντρωση άλατος καθορίζει τις ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των υπομονάδων ΝΤ και τον διμερισμό της μεταφοράς ΝΤ σε χαμηλότερο pH18.Βρήκαμε ότι η παρουσία 154 mM NaCl και NaF πράγματι ανέστειλε τη ζελατινοποίηση, αντίστοιχα (Εικ. 5a, b, Συμπληρωματικό Σχήμα 2b) και ότι αυτά τα άλατα αύξησαν τη θερμική σταθερότητα των μονομερών NT (Εικ. 5b, Συμπληρωματικό Σχήμα 8). .Υποδηλώνει επίσης ότι η ενίσχυση της σταθερότητας, αντί του διμερισμού, αποτρέπει το σχηματισμό γέλης.
Για να διερευνήσουμε περαιτέρω τον ρόλο του διμερισμού και της σταθερότητας της πρωτεΐνης στη ζελατινοποίηση, χρησιμοποιήσαμε δύο μεταλλάκτες, τα NT* και NTA72R, τα οποία παραμένουν επίσης μονομερή σε χαμηλό pH 28,30.Το NT* είναι ένα μετάλλαγμα αντιστροφής διπλού φορτίου στο οποίο η φαινομενική διπολική κατανομή φορτίου του μονομερούς είναι ισοπεδωμένη, γεγονός που αποτρέπει τον διμερισμό και αυξάνει δραστικά τη σταθερότητα του μονομερούς.Το NTA72R είναι ένα φορτισμένο δίπολο, αλλά το Arg-υποκατεστημένο Ala βρίσκεται στο όριο του διμερούς, επομένως οι μεταλλάξεις παρεμβαίνουν στις αλληλεπιδράσεις υπομονάδας που απαιτούνται για τον διμερισμό.Κατά την επώαση στους 37°C, το NT* δεν σχημάτισε υδρογέλη, ενώ το NTA72R σχημάτισε ένα αδιαφανές πήκτωμα για 15 λεπτά (Εικ. 5c).Εφόσον τόσο το NT* όσο και το NTA72R δεν μπορούν να διμεριστούν αλλά διαφέρουν ως προς τη σταθερότητα του μονομερούς (Εικ. 5δ), αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν έντονα ότι η υψηλή θερμοδυναμική σταθερότητα εμποδίζει το NT να σχηματίσει πηκτή.Αυτό υποστηρίζεται επίσης από το γεγονός ότι το HT* σχηματίζει ένα πήκτωμα όταν είναι ασταθές σε υψηλή θερμοκρασία (μετά από 8 λεπτά στους 60°C, Εικ. 5c).Έχει αποδειχθεί προηγουμένως ότι η υψηλή περιεκτικότητα σε μεθειονίνη σε NT υγροποιεί τη φυσική της αναδίπλωση και ότι έξι υποκατάστατα Met σε Leu (που αναφέρονται εδώ ως His-NT-L6) σταθεροποιούν έντονα το μονομερές NT46.Με βάση την υπόθεση ότι απαιτείται δομική ευελιξία για το σχηματισμό γέλης ΝΤ, βρήκαμε ότι το σταθερό μετάλλαγμα His-NT-L6 δεν πηκτωματοποιήθηκε στους 37 °C (Εικόνα 5c, d).Ωστόσο, το His-NT-L6 σχημάτισε επίσης ένα πήκτωμα κατά την επώαση στους 60°C για 60 λεπτά (Εικ. 5c).
Η ικανότητα του ΝΤ να μετασχηματίζεται σε δομές β-φύλλων και να σχηματίζει υδρογέλες φαίνεται να ισχύει για ορισμένες αλλά όχι όλες τις περιοχές ΝΤ της spidroin.Τα NT από διαφορετικούς τύπους μεταξιού και είδη αράχνης, Trichonephila clavipe (NTFlSp), σχημάτισαν πηκτώματα παρά τη σχετικά χαμηλή περιεκτικότητά τους σε μεθειονίνη και την υψηλή θερμική σταθερότητά τους (Εικ. 5e, f και Συμπληρωματικός Πίνακας 2).Αντίθετα, η NT από τη μικρή αμπυλική πρωτεΐνη spidroin από τον Araneus ventricosus (NTMiSp) με χαμηλή θερμική σταθερότητα και υψηλή περιεκτικότητα σε μεθειονίνη δεν σχημάτισε υδρογέλες (Συμπληρωματικός Πίνακας 2 και Εικ. 5e, f).Το τελευταίο μπορεί να σχετίζεται με την παρουσία ενδομοριακών δισουλφιδικών δεσμών29,47.Κατά συνέπεια, όταν οι δισουλφιδικοί δεσμοί του NTMiSp μειώθηκαν, σχημάτισε μια υδρογέλη μετά από επώαση στους 37°C για 10 λεπτά (Εικ. 5e).Συμπερασματικά, πρέπει να σημειωθεί ότι η δομική ευκαμψία είναι ένα σημαντικό, αλλά όχι το μοναδικό, κριτήριο για το σχηματισμό πηκτής από NT.Ένας άλλος παράγοντας που μπορεί να είναι σχετικός είναι η τάση σχηματισμού ινιδίων αμυλοειδούς και η ανάλυση με τη βάση δεδομένων φερμουάρ και τον αλγόριθμο Waltz έδειξε συσχέτιση μεταξύ της ικανότητας σχηματισμού πηκτωμάτων και της παρουσίας αμυλοειδογόνων περιοχών, καθώς και της έκτασης των προβλεπόμενων περιοχών για σχηματισμό στερεοχημικών φερμουάρ.Υπήρχε συσχέτιση (Συμπληρωματικός Πίνακας 2 και Συμπληρωματικό Σχήμα 9).
Η ικανότητα του ΝΤ να σχηματίζει ινίδια και να σχηματίζει πηκτές κάτω από ευνοϊκές συνθήκες μας οδήγησε να υποθέσουμε ότι οι συγχωνεύσεις ΝΤ με άλλα θραύσματα πρωτεΐνης μπορούν ακόμα να σχηματίσουν πηκτές με πλήρη λειτουργία των συνεργατών σύντηξης.Για να το ελέγξουμε αυτό, εισαγάγαμε πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP) και νουκλεοσιδική φωσφορυλάση πουρίνης (PNP) στο C-άκρο του NT, αντίστοιχα.Οι πρωτεΐνες σύντηξης που προέκυψαν εκφράστηκαν σε E. coli με πολύ υψηλές τελικές αποδόσεις (καλλιέργειες αναδευόμενης φιάλης 150 mg/L και 256 mg/L για His-NT-GFP και His-NT-PNP, αντίστοιχα), σύμφωνα με αυτό που έχει δειχθεί για Άλλες πρωτεΐνες συντηγμένες με ΝΤ Αναφ.30. Οι συντηγμένες πρωτεΐνες His-NT-GFP (300 mg/mL) και His-NT-PNP (100 mg/mL) σχημάτισαν γέλες μετά από 2 ώρες και 6,5 ώρες στους 37°C και, σημαντικό, το κλάσμα GFP παρέμεινε αμετάβλητο.παρατηρήθηκε μετά τη ζελατινοποίηση, με >70% της αρχικής έντασης φθορισμού να παραμένει μετά τη ζελατινοποίηση (Εικ. 6α).Για να μετρήσουμε τη δραστηριότητα PNP σε διαλύματα και πηκτές his-NT-PNP, έπρεπε να αραιώσουμε την πρωτεΐνη σύντηξης με NT επειδή η ενζυματική δραστηριότητα του καθαρού παρασκευάσματος ήταν εκτός του εύρους ανίχνευσης της δοκιμασίας σε συγκεντρώσεις πηκτώματος.Το πήκτωμα που σχηματίστηκε με ένα μίγμα που περιείχε 0,01 mg/mL His-NT-PNP και 100 mg/mL ΝΤ διατήρησε το 65% της αρχικής ενζυματικής δραστηριότητας των προεπωασμένων δειγμάτων (Εικ. 6b).Το πήκτωμα παρέμεινε ανέπαφο κατά τη διάρκεια της μέτρησης (Συμπληρωματικό Σχ. 10).
μια σχετική ένταση φθορισμού πριν και μετά τη ζελατινοποίηση του His-NT-GFP (300 mg/mL) και του ανεστραμμένου φιαλιδίου που περιέχει υδρογέλη His-NT-GFP (300 mg/mL) υπό ορατό και υπεριώδες φως.Τα σημεία δείχνουν μεμονωμένες μετρήσεις (n = 3), οι γραμμές σφαλμάτων δείχνουν τυπική απόκλιση.Η μέση τιμή εμφανίζεται στο κέντρο των γραμμών σφάλματος.β Δραστικότητα ΡΝΡ λήφθηκε με φθορομετρική ανάλυση χρησιμοποιώντας διαλύματα και γέλες που αποτελούνταν από ΝΤ (100 mg/ml) και ένα μείγμα που περιέχει 0,01 mg/ml his-NT-PNP και 100 mg/ml Νέα δολάρια Ταϊβάν.Το ένθετο δείχνει ένα ανεστραμμένο φιαλίδιο που περιέχει μια υδρογέλη που περιέχει His-NT-PNP (γραμμή κλίμακας 5 mm).
Εδώ, αναφέρουμε τον σχηματισμό υδρογέλης από NT και άλλες ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες spidroin με επώαση ενός διαλύματος πρωτεΐνης στους 37°C (Εικόνα 1).Δείχνουμε ότι η ζελατινοποίηση σχετίζεται με τον μετασχηματισμό των α-έλικων σε β-στιβάδες και το σχηματισμό ινιδίων που μοιάζουν με αμυλοειδές (Εικ. 3 και 4).Αυτό το εύρημα προκαλεί έκπληξη καθώς τα NT είναι περιελιγμένες σφαιρικές δέσμες πέντε έλικας γνωστές για την εξαιρετικά υψηλή διαλυτότητά τους και υψηλή σταθερότητα σε συγκεντρώσεις >200 mg/mL στους 4°C για αρκετές ημέρες27.Επιπλέον, τα NT αναδιπλώνονται εύκολα μετά τη θερμική μετουσίωση σε χαμηλές συγκεντρώσεις πρωτεΐνης σε μΜ.Σύμφωνα με τα αποτελέσματά μας, ο σχηματισμός ινιδίων απαιτεί συνδυασμό συγκέντρωσης πρωτεΐνης >10 mg/mL και ελαφρώς αυξημένης θερμοκρασίας (Εικ. 1).Αυτό είναι σύμφωνο με την ιδέα ότι τα ινίδια αμυλοειδούς μπορούν να σχηματιστούν από σφαιρικά διπλωμένες πρωτεΐνες που βρίσκονται σε μερικώς ξεδιπλωμένη κατάσταση λόγω θερμικών διακυμάνσεων υπό φυσιολογικές συνθήκες 48 .Παραδείγματα πρωτεϊνών που υφίστανται αυτή τη μετατροπή περιλαμβάνουν ινσουλίνη49,50, β2-μικροσφαιρίνη, τρανσθυρετίνη και λυσοζύμη51,52,53.Αν και το NT είναι μια α-έλικα στη φυσική του κατάσταση, περίπου το 65% της πολυπεπτιδικής αλυσίδας είναι συμβατό με το σχηματισμό στερεοειδούς φερμουάρ (Εικ. 4e) 45 .Δεδομένου ότι το μονομερές είναι δυναμικά κινητό46, μπορεί να εκθέσει αυτές τις πιθανές αμυλοειδογόνες περιοχές σε μέτρια υψηλές θερμοκρασίες και σε υψηλές συγκεντρώσεις ολικής πρωτεΐνης μπορεί να φτάσει σε κρίσιμη συγκέντρωση για το σχηματισμό ινιδίων αμυλοειδούς54.Ακολουθώντας αυτό το σκεπτικό, βρήκαμε μια αρνητική συσχέτιση μεταξύ της συγκέντρωσης spidroin και του χρόνου ζελατινοποίησης (Εικ. 1c), και εάν η μονομερής διαμόρφωση NT σταθεροποιηθεί είτε με μεταλλάξεις (NT*, His-NT-L6) είτε με προσθήκη άλατος, μπορεί να αποτρέψει την υδρογέλες σχηματισμού (Εικ. 5).
Στις περισσότερες περιπτώσεις, τα ινίδια αμυλοειδούς εξαφανίζονται από το διάλυμα ως ίζημα, αλλά υπό ορισμένες συνθήκες μπορούν να σχηματίσουν υδρογέλες55,56,57.Τα ινίδια που σχηματίζουν υδρογέλη έχουν συνήθως υψηλή αναλογία διαστάσεων και σχηματίζουν σταθερά τρισδιάστατα δίκτυα μέσω της μοριακής εμπλοκής, 55,58 σύμφωνα με τα αποτελέσματά μας.Για τον σχηματισμό υδρογέλης in vitro, οι πρωτεΐνες συχνά ξεδιπλώνονται πλήρως ή μερικώς, για παράδειγμα, με έκθεση σε οργανικούς διαλύτες, υψηλή θερμοκρασία (70–90°C) και/ή χαμηλό pH (1,5–3,0) 59,60,61,62.Οι υδρογέλες spidroin που περιγράφονται εδώ δεν απαιτούν σκληρή επεξεργασία, ούτε απαιτούν παράγοντες διασταύρωσης για τη σταθεροποίηση των υδροπηκτωμάτων.
Έχει αναφερθεί προηγουμένως ότι οι επαναλήψεις spidroin και τα QDs, τα οποία φαίνεται να υφίστανται εναλλαγή β-φύλλων κατά την κλώση του μεταξιού, σχηματίζουν υδρογέλες.Σε σύγκριση με τα ευρήματά μας, οι χρόνοι επώασης και/ή οι θερμοκρασίες επώασης ήταν σημαντικά μεγαλύτεροι ή υψηλότερες, αντίστοιχα, και οι προκύπτουσες υδρογέλες ήταν συχνά αδιαφανείς (Εικόνα 7 και Συμπληρωματικός Πίνακας 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. Εκτός από τους γρήγορους χρόνους γέλης, οι υδρογέλες NT >300 mg/mL (30%) ξεπέρασαν όλες τις άλλες περιγραφείσες υδρογέλες πρωτεΐνης ανασυνδυασμένου μεταξιού αράχνης, καθώς και τις φυσικές υδρογέλες όπως ζελατίνη, αλγινικό (2%), άγαρ (0,5 %) ) και το κολλαγόνο.(0,6%) (Εικόνα 7 και συμπληρωματικοί πίνακες 1 και 3)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
Ο χρόνος γέλης και ο συντελεστής ελαστικότητας των υδρογελών σε αυτή τη μελέτη συγκρίθηκαν με άλλες υδρογέλες που βασίζονται σε σπινδροΐνη και επιλεγμένες φυσικές υδρογέλες.Δίδονται αναφορές μαζί με περιγραφή των συνθηκών σχηματισμού γέλης.APS Υπερθειικό αμμώνιο, θερμοκρασία δωματίου.Δεδομένα 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
Οι αράχνες φαίνεται ότι έχουν αναπτύξει τρόπους για να αποτρέψουν τη γέληση της spidroin κατά την αποθήκευση.Παρά την υψηλή συγκέντρωση πρωτεΐνης στον αδένα του μεταξιού, η μεγάλη περιοχή επανάληψης που σχετίζεται με την τελική περιοχή σημαίνει ότι η φαινομενική συγκέντρωση NT και CT στον αδένα αντιστοιχεί περίπου σε 10-20 mg/ml, στο όριο αυτής της μελέτης.απαιτείται για τον in vitro παρατηρούμενο σχηματισμό υδρογέλης.Επιπλέον, παρόμοιες συγκεντρώσεις αλάτων 16 σταθεροποίησαν το ΝΤ, όπως στους αδένες του μεταξιού (Εικ. 5β).Η διαμόρφωση NT έχει μελετηθεί στο κυτοσόλιο E. coli και βρέθηκε ότι είναι πιο σφιχτά διπλωμένη από ό,τι όταν εξετάστηκε in vitro, υποδεικνύοντας περαιτέρω ότι το άλας ή άλλοι παράγοντες εμποδίζουν τη συσσώρευσή του in vivo.Ωστόσο, η ικανότητα των NT να μετασχηματίζονται σε ινίδια β-φύλλων μπορεί να είναι σημαντική για το σχηματισμό νημάτων και θα πρέπει να διερευνηθεί σε μελλοντικές μελέτες.
Εκτός από τις νέες πτυχές του σχηματισμού ινιδίων και υδρογέλης τύπου ΝΤ-αμυλοειδούς που παρατηρήθηκαν σε αυτή τη μελέτη, δείχνουμε επίσης ότι αυτό το φαινόμενο μπορεί να έχει βιοτεχνολογικές και βιοϊατρικές εφαρμογές (Εικ. 8).Ως απόδειξη της ιδέας, συνδυάσαμε NT με GFP ή PNP και δείξαμε ότι η πρωτεΐνη σύντηξης σχηματίζει επίσης υδρογέλες όταν επωάζεται στους 37 °C και ότι τα κλάσματα GFP και PNP διατηρούν σε μεγάλο βαθμό τη δραστηριότητά τους μετά τη ζελατινοποίηση (Εικόνα 6).Οι νουκλεοσιδικές φωσφορυλάσες είναι σημαντικοί καταλύτες σύνθεσης νουκλεοσιδικών αναλόγων75, γεγονός που καθιστά την ανακάλυψή μας σημαντική για τη βιοφαρμακευτική βιομηχανία.Η ιδέα της έκφρασης πρωτεϊνών σύντηξης που σχηματίζουν διαφανείς υδρογέλες υπό ευνοϊκές συνθήκες επιτρέπει τη δημιουργία λειτουργικών υδρογελών με ευνοϊκές ιδιότητες για ένα ευρύ φάσμα εφαρμογών όπως η ακινητοποίηση ενζύμων, η ελεγχόμενη απελευθέρωση φαρμάκου και η μηχανική ιστών.Επιπλέον, τα NT και NT* είναι αποτελεσματικοί δείκτες έκφρασης30, πράγμα που σημαίνει ότι το NT και οι παραλλαγές του μπορούν να χρησιμοποιηθούν για παραγωγή υψηλής απόδοσης διαλυτών πρωτεϊνών σύντηξης και επακόλουθη δημιουργία ακινητοποιημένων πρωτεϊνών-στόχων σε τρισδιάστατες υδρογέλες.
Το NT είναι διαλυτό, α-ελικοειδές και σταθερό σε χαμηλές συγκεντρώσεις (μΜ) και 37°C.Στην ίδια θερμοκρασία, αλλά σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις (>10 mg/ml), το NT σχηματίζει πηκτές που αποτελούνται από ινίδια που μοιάζουν με αμυλοειδές.Οι πρωτεΐνες σύντηξης NT σχηματίζουν επίσης ινώδεις πηκτές με πλήρως λειτουργικά θραύσματα σύντηξης, επιτρέποντας σε διάφορες πρωτεΐνες να ακινητοποιηθούν σε τρισδιάστατες υδρογέλες χρησιμοποιώντας NT.Κάτω: NT (PDB: 4FBS) και απεικονίσεις δικτύων ινών και σχετικών πρωτεϊνικών δομών (υποτίθεται και δεν έχει σχεδιαστεί σε κλίμακα, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2pdbd21).
Τα κατασκευάσματα (βλέπε Συμπληρωματικό Πίνακα 4 για έναν πλήρη κατάλογο που περιλαμβάνει αλληλουχίες αμινοξέων) κλωνοποιήθηκαν στο πλασμίδιο ρΤ7 και μετασχηματίστηκαν σε Ε. coli BL21 (DE3).Επεξεργασμένα πλασμίδια που περιείχαν Ε. coli εμβολιάστηκαν σε ζωμό Luria συμπληρωμένο με καναμυκίνη (70 mg/l) και αναπτύχθηκαν όλη τη νύχτα στους 30°C και 250 rpm.Η καλλιέργεια στη συνέχεια εμβολιάστηκε 1/100 σε μέσο LB που περιείχε καναμυκίνη και καλλιεργήθηκε στους 30°C και 110 rpm μέχρις ότου το OD600 έφτασε στο 0,8.Για μελέτες NMR, βακτήρια αναπτύχθηκαν σε ελάχιστο μέσο Μ9 που περιέχει 2 g D-γλυκόζης 13C (Aldrich) και 1 g χλωριούχου αμμωνίου 15Ν (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) για σήμανση πρωτεΐνης με ισότοπα.Χαμηλώστε τη θερμοκρασία στους 20 βαθμούς Κελσίου και επάγετε έκφραση πρωτεΐνης με 0,15 mM ισοπροπυλθειογαλακτοπυρανοσίδη (τελική συγκέντρωση).Μετά από ολονύκτια έκφραση πρωτεΐνης, τα κύτταρα συλλέχθηκαν στα 7278xg, 4°C για 20 λεπτά.Τα κυτταρικά σφαιρίδια επαναιωρήθηκαν σε 20 mM Tris-HCl, ρΗ 8, και καταψύχθηκαν μέχρι περαιτέρω χρήση.Τα αποψυγμένα κύτταρα λύθηκαν χρησιμοποιώντας έναν κυτταρικό διασπαστή (μηχανές σειράς TS, Constant Systems Limited, Αγγλία) στα 30 kPa.Στη συνέχεια τα προϊόντα λύσης φυγοκεντρήθηκαν στα 25.000 g για 30 λεπτά στους 4°C.Για το NTMiSp, το ίζημα στη συνέχεια επαναιωρήθηκε σε 2 Μ ουρία, 20 mM Tris-HCl, ρΗ 8, και υποβλήθηκε σε υπερήχους για 2 λεπτά (2 δευτ. ενεργοποίηση/απενεργοποίηση, 65%), και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε ξανά στα 25.000 xg, στους 4° C. 30 λεπτά.Το υπερκείμενο φορτώθηκε σε στήλη Ni-NTA, πλύθηκε με 20 mM Tris-HCl, 2 mM ιμιδαζόλη, ρΗ 8, και τελικά η πρωτεΐνη εκλούστηκε με 20 mM Tris-HCl, 200 mM ιμιδαζόλη, ρΗ 8. Για τη δημιουργία NT2RepCT και NTCT, η πέψη θρομβίνης εισάγει τη θέση (ThrCleav) μεταξύ His και NT.Θέσεις διάσπασης θρομβίνης υπάρχουν επίσης στα His-NT-ThrCleav-2Rep (παράγει 2Rep), His-thioredoxin-ThrCleav-NT (παράγει NT), His-thioredoxin-ThrCleav-CT (παράγει CT), His-thioredoxin-ThrCleav-NT .* (παράγει NT*), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (παράγει NTA72R), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (παράγει NTF1Sp) και His-Sulphur Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (παράγει).Τα κατασκευάσματα υπέστησαν πέψη με θρομβίνη (1:1000) και υπέστησαν διαπίδυση όλη τη νύχτα στους 4° C. με 20 mM Tris-HCl, ρΗ 8, χρησιμοποιώντας μια μεμβράνη διαπίδυσης Spectra/Por με ουδό μοριακού βάρους 6-8 kDa.Μετά την αιμοκάθαρση, το διάλυμα φορτώνεται σε στήλη Ni-NTA και συλλέγεται το απόβλητο που περιέχει την πρωτεΐνη ενδιαφέροντος.Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν με μέτρηση της απορρόφησης UV στα 280 nm χρησιμοποιώντας τον συντελεστή απόσβεσης κάθε πρωτεΐνης, εκτός από την NTF1Sp, η οποία χρησιμοποίησε τη δοκιμασία Bradford σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.Η καθαρότητα προσδιορίστηκε με ηλεκτροφόρηση γέλης SDS πολυακρυλαμιδίου (4–20%) και χρώση Coomassie brilliant blue.Οι πρωτεΐνες συμπυκνώθηκαν χρησιμοποιώντας φίλτρα φυγοκέντρησης (VivaSpin 20, GE Healthcare) στα 4000 xg με αποκοπή μοριακού βάρους 10 kDa σε κύκλους 20 λεπτών.
Αποψύξτε το διάλυμα πρωτεΐνης και μεταφέρετε προσεκτικά 150 µl σε ένα διαυγές φιαλίδιο του 1 ml (8 x 40 mm Thermo Scientific).Οι σωλήνες καλύφθηκαν και σφραγίστηκαν με παραφίλμ για να αποτραπεί η εξάτμιση.Τα δείγματα (n = 3) επωάστηκαν στους 37°C ή 60°C και περιοδικά αναστράφηκαν για να παρατηρηθεί η ζελατινοποίηση.Τα δείγματα που δεν γέλησαν επωάστηκαν για τουλάχιστον μία εβδομάδα.Μειώστε τους δισουλφιδικούς δεσμούς NTMiSp με 10 mM DTT ανά 10 μΜ πρωτεΐνη.Για να αναλυθεί η ζελατινοποίηση των επικαλύψεων φυσικού μεταξιού αράχνης, κόπηκε η σουηδική αράχνη γέφυρας, οι δύο κύριοι αδένες τοποθετήθηκαν σε 200 μl ρυθμιστικού διαλύματος Tris-HCl 20 mM pH 8 και κόπηκαν για να επιτραπεί στην επικάλυψη να διαχωριστεί από τους αδένες..Τα περιεχόμενα των αδένων διαλύονται σε ρυθμιστικό διάλυμα, 50 μl για προσδιορισμό του ξηρού βάρους (με επώαση ανοιχτών φιαλιδίων στους 60 °C έως σταθερό βάρος) και 150 μl για ζελατινοποίηση στους 37 °C.
Η γεωμετρία/εργαλείο μέτρησης είναι κατασκευασμένη από ανοξείδωτο χάλυβα χρησιμοποιώντας παράλληλη πλάκα με διάμετρο κορυφής 20 mm και διάκενο 0,5 mm.Θερμάνετε το δείγμα από 25 °C στους 45 °C και ξανά στους 25 °C με ρυθμό 1 °C ανά λεπτό χρησιμοποιώντας μια πλάκα Peltier από ανοξείδωτο χάλυβα.Πραγματοποιήθηκαν μετρήσεις δόνησης σε συχνότητα 0,1 Hz και στη γραμμική ιξωδοελαστική περιοχή του υλικού σε παραμόρφωση 5% και 0,5% για δείγματα 100 mg/mL και 300–500 mg/mL, αντίστοιχα.Χρησιμοποιήστε έναν προσαρμοσμένο θάλαμο υγρασίας για να αποτρέψετε την εξάτμιση.Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Prism 9.
Για συλλογή φασμάτων υπέρυθρων (IR) σε θερμοκρασία δωματίου από 800 έως 3900 cm–1.Η συσκευή ATR, καθώς και η διαδρομή φωτός μέσω του φασματόμετρου, καθαρίζονται με ξηρό φιλτραρισμένο αέρα πριν και κατά τη διάρκεια του πειράματος.Διαλύματα (500 mg/mL για την ελαχιστοποίηση των κορυφών απορρόφησης νερού στα φάσματα) μεταφέρθηκαν με πιπέτα στους κρυστάλλους και σχηματίστηκαν πηκτές (500 mg/mL) πριν από τη μέτρηση και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν στους κρυστάλλους (η = 3).Καταγράφηκαν 1000 σαρώσεις με ανάλυση 2 cm-1 και μηδενικό κύκλο λειτουργίας 2. Η δεύτερη παράγωγος υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας OPUS (Bruker) χρησιμοποιώντας ένα εύρος εξομάλυνσης εννέα σημείων.Τα φάσματα κανονικοποιήθηκαν στην ίδια περιοχή ολοκλήρωσης μεταξύ 1720 και 1580 cm-1 χρησιμοποιώντας το F. Menges «Spectragryph – Optical Spectroscopy Software».Στη φασματοσκοπία ATR-IR, το βάθος διείσδυσης μιας δέσμης υπέρυθρης ακτινοβολίας σε ένα δείγμα εξαρτάται από τον κυματικό αριθμό, με αποτέλεσμα την ισχυρότερη απορρόφηση σε χαμηλότερους κυματικούς αριθμούς από ό,τι σε υψηλότερους κυματικούς αριθμούς.Αυτά τα φαινόμενα δεν έχουν διορθωθεί για τα φάσματα που φαίνονται στα Σχ.3 επειδή είναι πολύ μικρά (Συμπληρωματικό Σχ. 4).Τα διορθωμένα φάσματα για αυτό το σχήμα υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Bruker OPUS.
Κατ' αρχήν, είναι δυνατός ένας ολοκληρωμένος ποσοτικός προσδιορισμός των διαμορφώσεων πρωτεΐνης μετά από αξιόπιστη αποσυνέλιξη των συστατικών εντός της κορυφής αμιδίου Ι.Ωστόσο, στην πράξη προκύπτουν ορισμένα εμπόδια.Ο θόρυβος στο φάσμα μπορεί να εμφανιστεί ως (ψευδείς) κορυφές κατά την αποσυνέλιξη.Επιπλέον, η κορυφή λόγω κάμψης του νερού συμπίπτει με τη θέση της κορυφής του αμιδίου Ι και μπορεί να έχει παρόμοιο μέγεθος για δείγματα που περιέχουν μεγάλη ποσότητα νερού, όπως το υδατικό πήκτωμα που μελετήθηκε εδώ.Επομένως, δεν επιχειρήσαμε να αποσυνθέσουμε πλήρως την κορυφή αμιδίου Ι και οι παρατηρήσεις μας θα πρέπει να ληφθούν υπόψη μόνο για την υποστήριξη άλλων μεθόδων όπως η φασματοσκοπία NMR.
Διαλύματα 50 mg/ml ΝΤ και His-NT2RepCT πηκτωματοποιήθηκαν όλη τη νύχτα στους 37°C.Η υδρογέλη στη συνέχεια αραιώθηκε με 20 mM Tris-HCl (ρΗ 8) σε συγκέντρωση 12,5 mg/ml, ανακινήθηκε καλά και μεταφέρθηκε με πιπέτα για να σπάσει το πήκτωμα.Στη συνέχεια, η υδρογέλη αραιώθηκε 10 φορές με 20 mM Tris-HCl (ρΗ 8), 5 μl του δείγματος εφαρμόστηκαν σε ένα χάλκινο πλέγμα επικαλυμμένο με formvar και η περίσσεια του δείγματος αφαιρέθηκε με στυπόχαρτο.Τα δείγματα πλύθηκαν δύο φορές με 5 μΐ νερού MilliQ και χρωματίστηκαν με 1% μυρμηκικό ουρανύλιο για 5 λεπτά.Αφαιρέστε τον υπερβολικό λεκέ με απορροφητικό χαρτί και στη συνέχεια στεγνώστε το πλέγμα στον αέρα.Η απεικόνιση πραγματοποιήθηκε σε αυτά τα δίκτυα χρησιμοποιώντας ένα FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN που λειτουργεί στα 100 kV.Οι εικόνες καταγράφηκαν σε μεγεθύνσεις x 26.500 και x 43.000 χρησιμοποιώντας μια κάμερα CCD Veleta 2k × 2k (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, Γερμανία).Για κάθε δείγμα (n = 1), καταγράφηκαν 10–15 εικόνες.Το ImageJ (https://imagej.nih.gov/) χρησιμοποιήθηκε για ανάλυση εικόνας και μέτρηση διαμέτρων ινών (n = 100, διαφορετικές ίνες).Το Prism 9 χρησιμοποιήθηκε για την εκτέλεση μη ζευγαρωμένων t-test (two-tailed).Τα μέσα His-NT2RepCT και NT ινίδια ήταν 11,43 (SD 2,035) και 7,67 (SD 1,389) nm, αντίστοιχα.Το διάστημα εμπιστοσύνης (95%) είναι -4,246 έως -3,275.βαθμοί ελευθερίας = 198, p < 0,0001.
80 μΙ υγρών δειγμάτων που περιείχαν 10 μΜ θειοφλαβίνης Τ (ThT) μετρήθηκαν εις τριπλούν (η = 3) υπό στατικές συνθήκες χρησιμοποιώντας πλάκες διαφανούς πυθμένα με μαύρο πυθμένα Corning 96 φρεατίων (Corning Glass 3881, USA).Οι διαφορές φθορισμού καταγράφηκαν χρησιμοποιώντας ένα φίλτρο διέγερσης 440 nm και ένα φίλτρο εκπομπής 480 nm (FLUOStar Galaxy από την BMG Labtech, Offenburg, Γερμανία).Το σήμα ThT δεν ήταν ούτε κορεσμένο ούτε σβήστηκε, καθώς πραγματοποιήθηκαν πειράματα με διαφορετικές συγκεντρώσεις ThT χωρίς αλλαγή της έντασης του σήματος.Καταγράψτε την απορρόφηση στα 360 nm για μέτρηση θολότητας.Για πειράματα σποράς, γέλες 100 mg/mL σχηματίστηκαν στους 37°C, επαναιωρήθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν για σπορά σε μοριακές αναλογίες 5%, 10% και 20%.Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Prism 9.
Αποψύξτε τα αποθέματα His-NT2RepCT και NT >100 mg/mL σε πάγο και διηθήστε μέσω φίλτρου 0,22 μm.Οι συγκεντρώσεις υπολογίστηκαν με μέτρηση της απορρόφησης στα 280 nm χρησιμοποιώντας Nanodrop.Σε φρεάτια μαύρης μη δεσμευτικής πλάκας 96 φρεατίων (Corning) με διαυγή πυθμένα, τα δείγματα αραιώθηκαν σε 20 mg/ml σε 20 mM Tris-HCl pH 8 και αναμίχθηκαν με 5 μM ThT (τελική συγκέντρωση), συνολική συγκέντρωση δείγματος όγκος 50 μl.Τα δείγματα απεικονίζονταν κάθε 10 λεπτά στους 37 °C σε μικροσκόπιο CellObserver (Zeiss) με κανάλι μεταδιδόμενου φωτός και σετ φίλτρων διέγερσης και εκπομπής FITC για απεικόνιση ThT.Ένας φακός 20x/0,4 χρησιμοποιείται για την απεικόνιση.Το Zen Blue (Zeiss) και το ImageJ (https://imagej.nih.gov/) χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση εικόνας.Παρασκευάστηκαν επίσης πηκτές από διαλύματα ΝΤ και His-NT2RepCT σε συγκέντρωση 50 mg/mL που περιείχε 20 mM Tris ρΗ 8 και 5 μΜ ThT και επωάστηκαν στους 37°C για 90 λεπτά.Τα κομμάτια γέλης μεταφέρθηκαν σε ένα νέο φρεάτιο που περιείχε 20 mM Tris, pH 8 και 5 μM ThT σε μια μη δεσμευτική μαύρη πλάκα διαφανούς πυθμένα 96 φρεατίων.Αποκτήστε εικόνες πράσινου φθορισμού και φωτεινού πεδίου σε μεγέθυνση 20x/0,4.Το ImageJ χρησιμοποιήθηκε για ανάλυση εικόνας.
Τα φάσματα NMR διαλύματος ελήφθησαν στους 310 Κ σε φασματόμετρο Bruker Avance Neo των 600 MHz εξοπλισμένο με κρυοανιχνευτή τετραπολικού συντονισμού παλμικού πεδίου κλίσης QCI (HFCN).Δείγματα NMR που περιέχουν 10 mg/mL ομοιογενούς πρωτεΐνης σημασμένη με 13C, 15Ν, διαλυμένα σε 20 mM Tris-HCl (ρΗ 8), 0,02% (β/ο) NaN3, 5% DO (v/v), (n = 1) .Χημικές μετατοπίσεις του NT2RepCT σε ρΗ 6,7 χρησιμοποιήθηκαν για να εκχωρηθεί η κορυφή 23 στο φάσμα 2D του 15N-HSQC.
Φάσματα στερεών NMR (MAS) περιστρεφόμενης μαγικής γωνίας υδρογέλης με σήμανση 13C, 15Ν καταγράφηκαν σε φασματόμετρο Bruker Avance III HD στα 800 MHz εξοπλισμένο με ανιχνευτή χωρίς ηλεκτρονικά 13C/15N{1H} 3,2 mm.Η θερμοκρασία του δείγματος ελέγχθηκε χρησιμοποιώντας ένα ρεύμα αερίου μεταβλητής θερμοκρασίας στους 277 Κ. Τα φάσματα διπολικού περιστροφικού συντονισμού (DARR)76 και επανασύνδεσης ραδιοσυχνοτήτων (RFDR)77 αποκτήθηκαν σε συχνότητες MAS 12,5 kHz και 20 kHz, αντίστοιχα.Η διασταυρούμενη πόλωση (CP) από 1H έως 13C πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας γραμμική ράμπα από 60,0 έως 48,0 kHz στο 1H, 61,3/71,6 kHz στους 13C (στα 12,5/20 kHz MAS) και χρόνο επαφής 0,5–1 ms.Η αποσύνδεση Spinal6478 στα 73,5 kHz χρησιμοποιήθηκε κατά τη συλλογή δεδομένων.Ο χρόνος απόκτησης ήταν 10 χιλιοστά του δευτερολέπτου και η καθυστέρηση του κύκλου ήταν 2,5 δευτερόλεπτα.Οι μονοσυνδεδεμένες συσχετίσεις α/Cβ που παρατηρήθηκαν στα φάσματα RFDR εκχωρήθηκαν με βάση τις χαρακτηριστικές χημικές μετατοπίσεις τύπου υπολείμματος και τις πολλαπλά συνδεδεμένες συσχετίσεις στα φάσματα DARR.
Η βάση δεδομένων Zipper79 (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση των τάσεων πτερυγισμού και της ενέργειας Rosetta για NT, NTFlSp και NTMiSp.Η βάση δεδομένων Zipper υπολογίζει το Rosetta Energy80, το οποίο συνδυάζει πολλές λειτουργίες ελεύθερης ενέργειας για να μοντελοποιήσει και να αναλύσει τη δομή της πρωτεΐνης.Ένα επίπεδο ενέργειας -23 kcal/mol ή χαμηλότερο υποδηλώνει υψηλή τάση για ινιδισμό.Η χαμηλότερη ενέργεια σημαίνει μεγαλύτερη σταθερότητα των δύο β-κλώνων στη διαμόρφωση του φερμουάρ.Επιπλέον, ο αλγόριθμος Waltz χρησιμοποιήθηκε για την πρόβλεψη αμυλοειδογόνων περιοχών σε NT, NTFlSp και NTMiSp Αναφ.81. (https://waltz.switchlab.org/).
Το διάλυμα πρωτεΐνης ΝΤ αναμίχθηκε με ρυθμιστικό διάλυμα 2-(Ν-μορφολινο)αιθανοσουλφονικού οξέος (MES) σε ρΗ 5,5 και 6,0 για μείωση του ρΗ σε ρΗ 6 και 7, αντίστοιχα.Η τελική συγκέντρωση πρωτεΐνης ήταν 100 mg/ml.
Οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν σε φασματόμετρο CD J-1500 (JASCO, ΗΠΑ) χρησιμοποιώντας κυψελίδα 300 μL με οπτική διαδρομή 0,1 cm.Οι πρωτεΐνες αραιώθηκαν σε 10 μΜ (n = 1) σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών 20 mM (ρΗ 8).Για να αναλυθεί η σταθερότητα της πρωτεΐνης παρουσία άλατος, οι πρωτεΐνες αναλύθηκαν στην ίδια συγκέντρωση (η = 1) σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών 20 mM (ρΗ 8) που περιέχει 154 mM NaF ή NaCl, αντίστοιχα.Οι σαρώσεις θερμοκρασίας καταγράφηκαν στα 222 nm από 25°C έως 95°C με ρυθμό θέρμανσης 1°C/λεπτό.Η αναλογία των εγγενώς διπλωμένων πρωτεϊνών υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον τύπο (KDmeasure – KDfinal)/(KDstart – KDfinal).Επιπλέον, καταγράφηκαν πέντε φάσματα για κάθε δείγμα από 260 nm έως 190 nm στους 25°C και μετά από θέρμανση στους 95°C.Υπολογίστηκαν κατά μέσο όρο πέντε φάσματα, εξομαλύνθηκαν και μετατράπηκαν σε μοριακή ελλειπτικότητα.Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Prism 9.
Η ένταση φθορισμού του His-NT-GFP (300 mg/mL, 80 μL) μετρήθηκε εις τριπλούν (η = 3) σε πλάκες Corning 96 φρεατίων με μαύρο διαφανή πυθμένα (Corning Glass 3881, USA) υπό στατικές συνθήκες.Μετρήστε τα δείγματα με συσκευή ανάγνωσης πλακών βασισμένη σε φθορισμό με μήκος κύματος διέγερσης 395 nm και καταγράψτε την εκπομπή στα 509 nm πριν από τη ζελατινοποίηση και 2 ώρες αργότερα στους 37°C.Τα δεδομένα αναλύθηκαν με Prism 9.
Χρησιμοποιήθηκε κιτ προσδιορισμού δραστηριότητας νουκλεοσιδικής φωσφορυλάσης πουρίνης (φθορομετρική μέθοδος, Sigma Aldrich) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.Για να μετρήσετε τη δραστηριότητα σε γέλες και διαλύματα που περιέχουν His-NT-PNP, αναμείξτε 10 ng His-NT-PNP με 100 mg/mL NT σε συνολικό όγκο 2 μL επειδή η γέλη έδωσε ένα σήμα πάνω από το διάστημα ανίχνευσης του σετ.Συμπεριλήφθηκαν μάρτυρες για γέλες και διαλύματα χωρίς His-NT-PNP.Οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν δύο φορές (n = 2).Αφού μετρήθηκε η δραστικότητα, το μίγμα της αντίδρασης απομακρύνθηκε και η γέλη φωτογραφήθηκε για να εξασφαλιστεί ότι η γέλη παρέμεινε ανέπαφη κατά τη διάρκεια της μέτρησης.Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Prism 9.
Για περισσότερες πληροφορίες σχετικά με το σχεδιασμό της μελέτης, ανατρέξτε στην περίληψη της μελέτης Nature που συνδέεται με αυτό το άρθρο.
Τα σχήματα 1 και 2 παρουσιάζουν τα αρχικά δεδομένα.1c, 2a–c, 3a, b, e–g, 4, 5b, d, f, και 6, Συμπληρωματικά Σχ.3, συμπληρωματική εικ.5α, δ, συμπληρωματική εικ.6 και συμπληρωματικό σχ.8. Δεδομένα Τα δεδομένα από αυτήν τη μελέτη φιλοξενούνται στη βάση δεδομένων Zenodo https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.Τα δεδομένα NMR που ελήφθησαν σε αυτή τη μελέτη δημοσιεύτηκαν στο αποθετήριο BMRBig με το αναγνωριστικό καταχώρισης bmrbig36.Οι δομές των GFP και PNP ελήφθησαν από PDB (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2).
Rising, A. and Johansson, J. Spinning τεχνητό μετάξι αράχνης.National Chemical.βιολογία.11, 309–315 (2015).
Babb, PL et αϊ.Το γονιδίωμα Nephila clavipe τονίζει την ποικιλομορφία των γονιδίων του μεταξιού της αράχνης και την πολύπλοκη έκφρασή τους.National Genette.49, 895–903 (2017).