347 12,7*1,24mm Σωληνώσεις από ανοξείδωτο χάλυβα ,Μοριακός μηχανισμός σύγχρονης ηλεκτροστατικής συμπύκνωσης και συσσωμάτωσης α-συνουκλεΐνης και ταυ

Σας ευχαριστούμε που επισκεφτήκατε το Nature.com.Χρησιμοποιείτε μια έκδοση προγράμματος περιήγησης με περιορισμένη υποστήριξη CSS.Για την καλύτερη εμπειρία, συνιστούμε να χρησιμοποιήσετε ένα ενημερωμένο πρόγραμμα περιήγησης (ή να απενεργοποιήσετε τη λειτουργία συμβατότητας στον Internet Explorer).Επιπλέον, για να διασφαλίσουμε τη συνεχή υποστήριξη, εμφανίζουμε τον ιστότοπο χωρίς στυλ και JavaScript.
Ρυθμιστικά που εμφανίζουν τρία άρθρα ανά διαφάνεια.Χρησιμοποιήστε τα κουμπιά πίσω και επόμενο για να μετακινηθείτε στις διαφάνειες ή τα κουμπιά του ελεγκτή ολίσθησης στο τέλος για να μετακινηθείτε σε κάθε διαφάνεια.

347 Προδιαγραφή σωλήνων από ανοξείδωτο χάλυβα

347 Σωληνώσεις 12,7*1,24mm από ανοξείδωτο χάλυβα

Εξωτερική διάμετρος: 6,00 mm OD έως 914,4 mm OD, Μεγέθη έως 24” NB διαθέσιμα Ex-stock, OD Size Steel Tubes διαθέσιμα Ex-stock

Εύρος πάχους σωλήνων SS 347: 0,3 mm – 50 mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S, κ.λπ. (0,5-12 mm) Ή μη κανονικό μέγεθος που πρέπει να προσαρμόζεται όπως απαιτείται

Τύπος: SS 347 Σωλήνες χωρίς ραφή |Σωλήνες SS 347 ERW |SS 347 Συγκολλημένοι Σωλήνες |SS 347 Fabricated Pipes |Σωλήνες SS 347 CDW, Σωλήνες LSAW / Συγκολλημένοι με ραφή / Επανασχεδιασμένοι

Μορφή: SS 347 Round Pipes/ Tubes, SS 347 Square Pipes/ Tubes, SS 347 Rectangular Pipe/ Tubes, SS 347 Coiled Tubes, SS 347 “U” Shape, SS 347 Pan Cake Coils, SS 347 Hydraulic Tubes

Μήκος: Μονό Τυχαίο, Διπλό Τυχαίο & Απαιτούμενο Μήκος Άκρο: Απλό άκρο, Λοξοτομή, Πέλμα

Προστασία άκρου: Πλαστικά καπάκια |Εξωτερικό φινίρισμα: 2Β, Νο. 4, Νο. 1, Νο. 8 Φινίρισμα καθρέφτη για σωλήνες από ανοξείδωτο χάλυβα, φινίρισμα σύμφωνα με τις απαιτήσεις του πελάτη

Προϋπόθεση παράδοσης: Ανοπτημένο και τουρσί, γυαλισμένο, φωτεινό ανόπτηση, κρύο τραβηγμένο

Επιθεώρηση, Αναφορές Δοκιμών: Πιστοποιητικά δοκιμών μύλου, EN 10204 3.1, Χημικές αναφορές, Μηχανικές αναφορές, Αναφορές δοκιμών PMI, Εκθέσεις οπτικής επιθεώρησης, Εκθέσεις επιθεώρησης τρίτων, Αναφορές εργαστηρίου εγκεκριμένες από NABL, Αναφορές καταστροφικών δοκιμών, μη καταστροφικές αναφορές δοκιμών

Συσκευασία: Συσκευασμένο σε ξύλινα κουτιά, πλαστικές σακούλες, λωρίδες από χάλυβα σε συσκευασία ή σύμφωνα με τα αιτήματα των πελατών

Ειδικά: Μεγέθη και προδιαγραφές εκτός από τα παραπάνω μπορούν να κατασκευαστούν κατόπιν αιτήματος

Εύρος μεγέθους σωλήνα SS 347: 1/2 ίντσα NB, ​​OD έως 24 ίντσες

ASTM A312 347: Συγκολλημένος ωστενιτικός σωλήνας χωρίς ραφή και ευθεία ραφή που προορίζεται για υψηλές θερμοκρασίες και γενικά διαβρωτικά σέρβις.Το μέταλλο πλήρωσης δεν επιτρέπεται κατά τη συγκόλληση.

ASTM A358 347: Ηλεκτρικός ωστενιτικός σωλήνας συγκολλημένος με σύντηξη για διαβρωτικό και/ή σέρβις υψηλής θερμοκρασίας.Συνήθως παράγεται μόνο σωλήνας έως 8 ιντσών σύμφωνα με αυτήν την προδιαγραφή.Κατά τη συγκόλληση επιτρέπεται η προσθήκη μετάλλου πλήρωσης.

ASTM A790 347: Συγκολλημένος φερριτικός/ωστενιτικός (διπλής όψης) σωλήνας χωρίς ραφή και ευθείας ραφής που προορίζεται για γενική διαβρωτική συντήρηση, με ιδιαίτερη έμφαση στην αντοχή στη διάβρωση λόγω καταπόνησης.

ASTM A409 347: Ηλεκτρικός συγκολλημένος σωλήνας ωστενιτικού ελαφρού τοιχώματος μεγάλης διαμέτρου ευθείας ραφής ή σπειροειδούς ραφής σε μεγέθη 14" έως 30" με τοιχώματα Sch5S και Sch 10S για διαβρωτικό και/ή υψηλό

ASTM A376 347: Ωστενιτικός σωλήνας χωρίς ραφή για εφαρμογές υψηλής θερμοκρασίας.

ASTM A813 347: Ωστενιτικός σωλήνας μονής ραφής, μονής ή διπλής συγκόλλησης για υψηλές θερμοκρασίες και γενικές διαβρωτικές εφαρμογές.

ASTM A814 347: Εν ψυχρώ συγκολλημένος ωστενιτικός σωλήνας για υψηλές θερμοκρασίες και γενική διαβρωτική υπηρεσία.

Χημική σύνθεση σωλήνων 347H από ανοξείδωτο χάλυβα

Μηχανικές ιδιότητες σωλήνων από ανοξείδωτο χάλυβα 347H

Φυσικές ιδιότητες σωλήνων από ανοξείδωτο χάλυβα 347H

Ισοδύναμες ποιότητες για σωλήνα από ανοξείδωτο χάλυβα 347H

Η συσσώρευση αμυλοειδούς άλφα-συνουκλεΐνης (αS) είναι χαρακτηριστικό γνώρισμα της νόσου του Πάρκινσον και άλλων συνουκλεϊνοπαθειών.Πρόσφατα, η πρωτεΐνη tau που συνήθως σχετίζεται με τη νόσο του Alzheimer έχει συσχετιστεί με την παθολογία του αS και βρέθηκε ότι συνεντοπίζεται σε εγκλείσματα πλούσια σε αS, αν και ο μοριακός μηχανισμός συσσωμάτωσης των δύο πρωτεϊνών παραμένει ασαφής.Αναφέρουμε εδώ ότι η φάση αS διαχωρίζεται σε υγρά συμπυκνώματα μέσω ηλεκτροστατικής συμπύκνωσης συμπλέγματος με θετικά φορτισμένα πολυπεπτίδια όπως το tau.Ανάλογα με τη συγγένεια του αS για τα πολυκατιόντα και τον ρυθμό εξάντλησης του σθένους του δικτύου πήξης, οι θρόμβοι υφίστανται ταχεία ζελατινοποίηση ή συνένωση που ακολουθείται από αργή συσσώρευση αμυλοειδούς.Συνδυάζοντας μια σειρά προηγμένων βιοφυσικών τεχνικών, μπορέσαμε να χαρακτηρίσουμε τον διαχωρισμό της φάσης υγρού-υγρού αS/Tau και να εντοπίσουμε τους βασικούς παράγοντες που οδηγούν στον σχηματισμό ετερογενών συσσωματωμάτων που περιέχουν και τις δύο πρωτεΐνες σε ένα συμπύκνωμα υγρής πρωτεΐνης.
Εκτός από τα διαμερίσματα μεμβράνης, ο χωρικός διαχωρισμός στα κύτταρα μπορεί επίσης να επιτευχθεί με το σχηματισμό πυκνών σωμάτων πλούσιων σε πρωτεΐνες, που μοιάζουν με υγρά, που ονομάζονται βιομοριακά συμπυκνώματα ή σταγονίδια, μέσω μιας διαδικασίας γνωστής ως διαχωρισμός υγρής-υγρής φάσης (LLPS).Αυτά τα σταγονίδια σχηματίζονται από πολυσθενείς χρονικές αλληλεπιδράσεις, συνήθως μεταξύ πρωτεϊνών ή πρωτεϊνών και RNA, και εξυπηρετούν μια ποικιλία λειτουργιών σχεδόν σε όλα τα ζωντανά συστήματα.Ένας μεγάλος αριθμός πρωτεϊνών με ικανότητα LLP εμφανίζει αλληλουχίες χαμηλής πολυπλοκότητας που είναι εξαιρετικά διαταραγμένες στη φύση και στο σχηματισμό βιομοριακών συμπυκνωμάτων3,4,5.Πολυάριθμες πειραματικές μελέτες έχουν αποκαλύψει την εύκαμπτη, συχνά διαταραγμένη και πολυσθενή φύση των πρωτεϊνών που συνθέτουν αυτά τα υγρά συμπυκνώματα, αν και λίγα είναι γνωστά για τους συγκεκριμένους μοριακούς καθοριστικούς παράγοντες που ελέγχουν την ανάπτυξη και την ωρίμανση αυτών των συμπυκνωμάτων σε πιο στερεά κατάσταση..
Τα νέα δεδομένα υποστηρίζουν την υπόθεση ότι το ανώμαλο πρωτεϊνικό LLPS και ο μετασχηματισμός των σταγονιδίων σε στερεές δομές μπορεί να είναι σχετικές κυτταρικές οδοί που οδηγούν στον σχηματισμό αδιάλυτων τοξικών συσσωματωμάτων που είναι συχνά χαρακτηριστικά εκφυλιστικών ασθενειών.Πολλές εγγενώς διαταραγμένες πρωτεΐνες (IDP) που σχετίζονται με το LLPS, συχνά πολύ φορτισμένες και εύκαμπτες, έχουν από καιρό συσχετιστεί με νευροεκφυλισμό μέσω της διαδικασίας συσσωμάτωσης αμυλοειδούς.Συγκεκριμένα, τα βιομοριακά συμπυκνώματα IDP όπως το FUS7 ή το TDP-438 ή πρωτεΐνες με μεγάλες περιοχές χαμηλής πολυπλοκότητας όπως το hnRNPA19 έχει αποδειχθεί ότι γερνούν σε μορφές που μοιάζουν με γέλη ή ακόμη και σε στερεές μορφές μέσω μιας διαδικασίας που ονομάζεται ρευστοποίηση.χημική ένωση.στη μετάβαση στερεάς φάσης (LSPT) ως συνάρτηση του χρόνου ή ως απόκριση σε ορισμένες μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις ή παθολογικά σημαντικές μεταλλάξεις1,7.
Ένα άλλο IDP που σχετίζεται με το LLPS in vivo είναι το Tau, μια διαταραγμένη πρωτεΐνη σχετιζόμενη με μικροσωληνίσκους της οποίας η συσσώρευση αμυλοειδούς έχει εμπλακεί στη νόσο του Alzheimer10 αλλά έχει επίσης ενοχοποιηθεί πρόσφατα στη νόσο του Parkinson (PD) και άλλες συναπτικές πυρηνικές πρωτεϊνοπάθειες 11, 12, 13 σχετίζονται.Το Tau έχει αποδειχθεί ότι διαχωρίζεται αυθόρμητα από το διάλυμα/κυτταρόπλασμα λόγω ευνοϊκών ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων14, με αποτέλεσμα τον σχηματισμό σταγονιδίων εμπλουτισμένων σε ταυ γνωστά ως ηλεκτροστατικά συνενώσεις.Έχει επίσης παρατηρηθεί ότι αυτός ο τύπος μη ειδικής αλληλεπίδρασης είναι η κινητήρια δύναμη πίσω από πολλά βιομοριακά συμπυκνώματα στη φύση15.Στην περίπτωση μιας πρωτεΐνης ταυ, η ηλεκτροστατική συσσωμάτωση μπορεί να σχηματιστεί με απλή συσσωμάτωση, στην οποία αντίθετα φορτισμένες περιοχές της πρωτεΐνης πυροδοτούν τη διαδικασία διάσπασης ή με πολύπλοκη συσσωμάτωση μέσω αλληλεπίδρασης με αρνητικά φορτισμένα πολυμερή όπως το RNA.
Πρόσφατα, η α-συνουκλεΐνη (αS), ένα αμυλοειδές IDP που εμπλέκεται σε PD και άλλες νευροεκφυλιστικές ασθένειες συλλογικά γνωστές ως συνουκλεϊνοπάθεια17,18, έχει αποδειχθεί σε κυτταρικά και ζωικά μοντέλα19,20 συγκεντρωμένη σε συμπυκνώματα πρωτεΐνης με συμπεριφορά παρόμοια με υγρό.Μελέτες in vitro έχουν δείξει ότι το αS υφίσταται LLPS με απλή συσσωμάτωση μέσω κυρίως υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων, αν και αυτή η διαδικασία απαιτεί εξαιρετικά υψηλές συγκεντρώσεις πρωτεΐνης και άτυπα μεγάλους χρόνους επώασης19,21.Το αν τα συμπυκνώματα που περιέχουν αS που παρατηρούνται in vivo σχηματίζονται από αυτήν ή άλλες διαδικασίες LLPS παραμένει ένα βασικό άλυτο ζήτημα.Παρομοίως, αν και έχει παρατηρηθεί συσσωμάτωση αS αμυλοειδούς σε νευρώνες σε PD και άλλες συνουκλεινοπάθειες, ο ακριβής μηχανισμός με τον οποίο το αS υφίσταται ενδοκυτταρική συσσωμάτωση αμυλοειδούς παραμένει ασαφής, καθώς η υπερέκφραση αυτής της πρωτεΐνης δεν φαίνεται να πυροδοτεί αυτή τη διαδικασία από μόνη της.Συχνά απαιτείται πρόσθετη κυτταρική βλάβη, υποδηλώνοντας ότι απαιτούνται ορισμένες κυτταρικές τοποθεσίες ή μικροπεριβάλλοντα για την επαναπυρήνωση των ενδοκυτταρικών συγκροτημάτων αμυλοειδούς αS.Ένα κυτταρικό περιβάλλον που είναι ιδιαίτερα επιρρεπές στη συσσωμάτωση μπορεί να είναι το εσωτερικό των πρωτεϊνικών συμπυκνωμάτων 23 .
Είναι ενδιαφέρον ότι το αS και το tau έχει βρεθεί ότι συνεντοπίζονται σε χαρακτηριστικές ασθένειες σε ανθρώπους με νόσο του Πάρκινσον και άλλες συνουκλεινοπάθειες 24,25 και τα πειράματα έχουν αναφέρει μια συνεργιστική παθολογική σχέση μεταξύ των δύο πρωτεϊνών 26,27 υποδηλώνοντας μια πιθανή σχέση μεταξύ της συσσωμάτωσης αS και tau σε νευροεκφυλιστικές ασθένειες.ασθένεια.Το αS και το tau έχει βρεθεί ότι αλληλεπιδρούν και προάγουν τη συσσώρευση του άλλου in vitro και in vivo 28,29 και ετερογενή συσσωματώματα που αποτελούνται από αυτές τις δύο πρωτεΐνες έχουν παρατηρηθεί στους εγκεφάλους ασθενών με συνουκλεϊνοπάθειες 30 .Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά για τη μοριακή βάση της αλληλεπίδρασης μεταξύ αS και ταυ και τον μηχανισμό της συν-συσσώρευσής του.Το αS έχει αναφερθεί ότι αλληλεπιδρά με το tau μέσω μιας ηλεκτροστατικής έλξης μεταξύ της εξαιρετικά αρνητικά φορτισμένης C-τερματικής περιοχής του αS και της κεντρικής πλούσιας σε προλίνη περιοχής του tau, η οποία είναι επίσης εμπλουτισμένη σε θετικά φορτισμένα υπολείμματα.
Σε αυτή τη μελέτη, δείχνουμε ότι το αS μπορεί πράγματι να διαχωριστεί σε σταγονίδια μέσω ηλεκτροστατικής συμπύκνωσης συμπλόκου παρουσία πρωτεΐνης tau, σε αντίθεση με την αλληλεπίδρασή του με άλλα θετικά φορτισμένα πολυπεπτίδια όπως η πολυ-L-λυσίνη (pLK) και σε αυτή τη διαδικασία .Το αS δρα ως μόριο ικριώματος για το δίκτυο σταγονιδίων.Έχουμε εντοπίσει αξιοσημείωτες διαφορές στη διαδικασία ωρίμανσης των ηλεκτροστατικών αS coacervates, οι οποίες σχετίζονται με διαφορές στο σθένος και την ισχύ της αλληλεπίδρασης των πρωτεϊνών που εμπλέκονται στο δίκτυο coacervate.Είναι ενδιαφέρον ότι παρατηρήσαμε τη συν-συσσωμάτωση των πρωτεϊνών αS και ταυ αμυλοειδούς σε μακρόβια υγρά συσσωμάτωμα και εντοπίσαμε ορισμένους βασικούς παράγοντες που οδηγούν σε συνσυσσωμάτωση αυτών των δύο πρωτεϊνών σε τέτοιου είδους συνενώσεις.Εδώ περιγράφουμε λεπτομερώς αυτή τη διαδικασία, η οποία είναι ένας πιθανός μοριακός μηχανισμός που βασίζεται στον εντοπισμό δύο πρωτεϊνών σε εγκλείσματα ειδικά για την ασθένεια.
Το αS έχει μια εξαιρετικά ανιονική C-τερματική ουρά σε ουδέτερο pH (Εικ. 1a) και υποθέσαμε ότι θα μπορούσε να υποστεί LLPS μέσω της συμπύκνωσης ηλεκτροστατικών συμπλεγμάτων με πολυκατιονικά διαταραγμένα πολυπεπτιδικά μόρια.Χρησιμοποιήσαμε ένα μόριο πολυ-L-λυσίνης 100 υπολειμμάτων (pLK) ως μόριο μοντέλου έναρξης λόγω της θετικά φορτισμένης και διαταραγμένης πολυμερικής φύσης του σε ουδέτερο pH 32. Αρχικά, επιβεβαιώσαμε ότι το pLK αλληλεπιδρά με την περιοχή Ct του αS μέσω φασματοσκοπίας NMR διαλύματος (Σχήμα 1β) χρησιμοποιώντας αS σημασμένο με 13C/15N παρουσία αυξανόμενων μοριακών αναλογιών αS:pLK.Η αλληλεπίδραση του pLK με την περιοχή Ct του αS εκδηλώνεται με διαταραχές της χημικής μετατόπισης και μείωση της έντασης κορυφής σε αυτή την περιοχή της πρωτεΐνης.Είναι ενδιαφέρον ότι όταν αναμίξαμε το αS με το pLK σε συγκέντρωση αS περίπου.5–25 μΜ παρουσία πολυαιθυλενογλυκόλης (5–15% PEG-8) (τυπικό ρυθμιστικό διάλυμα LLPS: 10 mM HEPES pH 7,4, 100 mM NaCl, 15% PEG-8) περάσαμε αμέσως από ένα ευρύ πεδίο σχηματισμού πρωτεϊνών .Τα σταγονίδια παρατηρήθηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκοπία φθορισμού (WF) και φωτεινού πεδίου (BF) (Εικ. 1c).Σταγονίδια 1-5 μm που περιέχουν συμπυκνωμένο αS (προστέθηκε 1 μΜ αS, AF488-αS με επισήμανση AlexaFluor488), οι ηλεκτροστατικές τους ιδιότητες μπορούν να προέλθουν από την αντίστασή τους σε 10% 1,6-εξανοδιόλη (1,6-HD) και την ευαισθησία του σε αύξηση της συγκέντρωσης NaCl (Εικ. 1γ).Η ρευστοειδής φύση των συσσωρευτών του ηλεκτροστατικού συμπλέγματος αS/pLK αποδεικνύεται από την ικανότητά τους να συντήκονται μέσα σε χιλιοστά του δευτερολέπτου (Εικ. 1δ).Χρησιμοποιώντας θολερότητα, ποσοτικοποιήσαμε το σχηματισμό σταγονιδίων κάτω από αυτές τις συνθήκες, επιβεβαιώσαμε την ηλεκτροστατική φύση της κύριας αλληλεπίδρασης που σχετίζεται με τη σταθερότητά της (Εικ. 1e) και αξιολογήσαμε την επίδραση διαφόρων αναλογιών πολυμερών στη διαδικασία LLPS (Εικ. 1στ).Αν και ο σχηματισμός σταγονιδίων παρατηρείται σε ένα ευρύ φάσμα αναλογιών πολυμερών, η διαδικασία είναι πολύ ευνοϊκή όταν το pLK είναι πάνω από αS.Τα LLP έχουν επίσης παρατηρηθεί χρησιμοποιώντας τον χημικά διαφορετικό παράγοντα εκτόπισης δεξτράνη-70 (70 kDa) ή χρησιμοποιώντας μια ποικιλία μορφών δειγμάτων, συμπεριλαμβανομένων σταγόνων γυάλινων πλακών, πηγαδιών μικροπλάκας από διάφορα υλικά, τριχοειδών Eppendorf ή χαλαζία.
μια Σχηματική αναπαράσταση διαφορετικών περιοχών πρωτεΐνης στις παραλλαγές WT-αS και ΔCt-αS που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη.Η αμφίπαθη Ν-τερματική περιοχή, η υδρόφοβη περιοχή σχηματισμού αμυλοειδούς (NAC) και η αρνητικά φορτισμένη Οτελική περιοχή εμφανίζονται με μπλε, πορτοκαλί και κόκκινο, αντίστοιχα.Εμφανίζεται ο χάρτης καθαρής χρέωσης ανά υπολειπόμενο (NCPR) του WT-αS.b Ανάλυση NMR της αS/pLK αλληλεπίδρασης απουσία μακρομοριακών συστάδων.Καθώς η συγκέντρωση pLK αυξάνεται (οι μοριακές αναλογίες αS:pLK 1:0,5, 1:1,5 και 1:10 εμφανίζονται με ανοιχτό πράσινο, πράσινο και σκούρο πράσινο, αντίστοιχα).c Coacervate αS/pLK (μοριακή αναλογία 1:10) στα 25 μΜ (1 μM σημασμένο με AF488 αS ή pLK με σήμανση Atto647N για απεικόνιση WF) σε ρυθμιστικό διάλυμα LLPS (πάνω) ή συμπληρωμένο με 500 mM NaCl (κάτω αριστερά) ή μετά από 10 % 1,6-εξανοδιόλη (1,6-HD, κάτω δεξιά).Μπάρα κλίμακας = 20 μm.d Αντιπροσωπευτικές μικροσκοπικές εικόνες σύντηξης σταγονιδίων BF αS/pLK (μοριακή αναλογία 1:10) σε συγκέντρωση 25 μM.Τα βέλη υποδεικνύουν τη συγχώνευση μεμονωμένων σταγόνων (κόκκινο και κίτρινο βέλος) σε μια νέα σταγόνα (πορτοκαλί βέλος) εντός 200 ms) .Μπάρα κλίμακας = 20 μm.e Σκέδαση φωτός (στα 350 nm) συσσωμάτωση αS/pLK σε ρυθμιστικό διάλυμα LLPS πριν και μετά την προσθήκη 500 mM NaCl ή 10% 1,6-HD στα 25 μΜ αS (Ν = 3 επαναλήψεις δειγμάτων, μέση και τυπική απόκλιση υποδεικνύονται επίσης).f εικόνας BF (πάνω) και ανάλυση σκέδασης φωτός (στα 350 nm, κάτω) της συσσωμάτωσης αS/pLK στα 25 μΜ αS με αυξανόμενη μοριακή αναλογία αS:pLK (Ν = 3 επαναλήψεις δειγμάτων, μέση και τυπική απόκλιση υποδεικνύονται επίσης).Γραμμή κλίμακας = 10 μm.Η γραμμή κλίμακας σε μία εικόνα υποδεικνύει την κλίμακα όλων των εικόνων σε ένα πλαίσιο.Τα ανεπεξέργαστα δεδομένα παρέχονται με τη μορφή αρχείων πρωτογενών δεδομένων.
Με βάση τις παρατηρήσεις μας για τη συμπύκνωση ηλεκτροστατικού συμπλέγματος αS/pLK και προηγούμενες παρατηρήσεις του αS ως μόριο πελάτη του συμπυκνώματος tau/RNA μέσω άμεσης αλληλεπίδρασης με το tau31, υποθέσαμε ότι το αS και το tau θα μπορούσαν να συνδιαχωριστούν με τον διαλύτη απουσία RNA συμπύκνωση.μέσω ηλεκτροστατικών συμπλεγμάτων, και το αS είναι η πρωτεΐνη ικριώματος στα συνενώσεις αS/Tau (βλ. κατανομή φορτίου tau στο Σχήμα 2e).Παρατηρήσαμε ότι όταν 10 μΜ αS και 10 μΜ Tau441 (που περιέχουν 1 μΜ AF488-αS και 1 μΜ Atto647N-Tau, αντίστοιχα) αναμίχθηκαν μαζί σε ρυθμιστικό διάλυμα LLPS, σχημάτισαν εύκολα πρωτεϊνικά συσσωματώματα που περιείχαν και τις δύο πρωτεΐνες, όπως φαίνεται από τη μικροσκοπία WF.(Εικ. 2α).Ο εντοπισμός των δύο πρωτεϊνών στα σταγονίδια επιβεβαιώθηκε με ομοεστιακή (CF) μικροσκοπία (Συμπληρωματικό Σχήμα 1α).Παρόμοια συμπεριφορά παρατηρήθηκε όταν η δεξτράνη-70 χρησιμοποιήθηκε ως παράγοντας συσσωμάτωσης (Συμπληρωματικό Σχήμα 1c).Χρησιμοποιώντας είτε PEG σημασμένο με FITC είτε δεξτράνη, βρήκαμε ότι και οι δύο παράγοντες συνωστισμού κατανεμήθηκαν ομοιόμορφα στα δείγματα, χωρίς να παρουσιάζουν διαχωρισμό ούτε συσχέτιση (Συμπληρωματικό Σχήμα 1δ).Αντιθέτως, προτείνει ότι σε αυτό το σύστημα προάγουν τον διαχωρισμό φάσεων μέσω των μακρομοριακών συνωστισμών, καθώς το PEG είναι ένας κατά προτίμηση σταθερός παράγοντας συνωστισμού, όπως φαίνεται σε άλλα συστήματα LLP33,34.Αυτά τα πλούσια σε πρωτεΐνες σταγονίδια ήταν ευαίσθητα στο NaCl (1 Μ) αλλά όχι στο 1,6-HD (10% v/v), επιβεβαιώνοντας τις ηλεκτροστατικές τους ιδιότητες (Συμπληρωματικό Σχήμα 2a, b).Η συμπεριφορά τους στα υγρά επιβεβαιώθηκε με παρατήρηση γεγονότων συγχώνευσης σταγονιδίων χιλιοστού του δευτερολέπτου χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο BF (Εικ. 2β).
Οι εικόνες με ομοεστιακή (CF) μικροσκοπία αS/Tau441 συνενώνονται σε ρυθμιστικό διάλυμα LLPS (10 μM από κάθε πρωτεΐνη, 0,5 μM αS με σήμανση AF488 και Tau441 με σήμανση Atto647N).β Αντιπροσωπευτικές εικόνες αντίθεσης διαφορικής παρεμβολής (DIC) συμβάντων σύντηξης σταγονιδίων αS/Tau441 (10 μΜ για κάθε πρωτεΐνη).γ Διάγραμμα φάσης που βασίζεται στη σκέδαση φωτός (στα 350 nm) του Tau441 LLPS (0–15 μM) απουσία (αριστερά) ή παρουσία (δεξιά) 50 μΜ αS.Τα πιο ζεστά χρώματα δείχνουν μεγαλύτερη διασπορά.d Σκέδαση φωτός δειγμάτων αS/Tau441 LLPS με αυξανόμενη συγκέντρωση αS (Tau441 στα 5 μΜ, N = 2–3 επαναλήψεις δειγμάτων όπως υποδεικνύεται).e Σχηματική αναπαράσταση ορισμένων παραλλαγών πρωτεΐνης tau και διαφορετικών περιοχών της πρωτεΐνης που χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη: αρνητικά φορτισμένη Ν-τερματική περιοχή (κόκκινο), περιοχή πλούσια σε προλίνη (μπλε), περιοχή σύνδεσης μικροσωληνίσκων (MTBD, τονισμένη με πορτοκαλί χρώμα) και σπείρα ζεύγους που σχηματίζει αμυλοειδές.περιοχές νήματος (PHF) που βρίσκονται εντός του MTBD (γκρι).Εμφανίζεται ο χάρτης Net Charge Per Residue (NCPR) του Tau441.f Χρησιμοποιώντας αS σημασμένο με AF488 1 μΜ και ΔNt- επισημασμένο με Atto647N, χρησιμοποιώντας αS ή ΔCt-α σημασμένο με 1 μΜ AF488 παρουσία ΔNt-Tau (πάνω, 10 μΜ ανά πρωτεΐνη) ή Κ18 (κάτω, 50 μΜ ανά πρωτεΐνη ) ) ) μικρογραφίες του WF συμπυκνωμένο σε buffer LLPS ή K18.Οι γραμμές κλίμακας σε μία εικόνα αντιπροσωπεύουν την κλίμακα όλων των εικόνων σε ένα πλαίσιο (20 μm για τα πλαίσια a, b και f).Τα πρωτογενή δεδομένα για τους πίνακες c και d παρέχονται ως αρχεία πρωτογενών δεδομένων.
Για να ελέγξουμε τον ρόλο του αS σε αυτή τη διαδικασία LLPS, ερευνήσαμε πρώτα την επίδραση του αS στη σταθερότητα των σταγονιδίων με νεφελομετρία χρησιμοποιώντας αυξανόμενες συγκεντρώσεις NaCl (Εικ. 2γ).Όσο υψηλότερη είναι η συγκέντρωση άλατος στα δείγματα που περιέχουν αS, τόσο υψηλότερες είναι οι τιμές σκέδασης φωτός (στα 350 nm), γεγονός που υποδεικνύει τον σταθεροποιητικό ρόλο του αS σε αυτό το σύστημα LLPS.Ένα παρόμοιο αποτέλεσμα μπορεί να παρατηρηθεί αυξάνοντας τη συγκέντρωση αS (και επομένως την αναλογία αS:Tau441) σε περίπου.10-πλάσια αύξηση σε σχέση με τη συγκέντρωση ταυ (5 μΜ) (Εικ. 2δ).Για να δείξουμε ότι το αS είναι μια πρωτεΐνη ικριώματος στα coacervates, αποφασίσαμε να διερευνήσουμε τη συμπεριφορά του μεταλλάγματος Tau που έχει διαταραχθεί από το LLPS, το οποίο στερείται αρνητικά φορτισμένης Ν-τερματικής περιοχής (υπολείμματα 1–150, βλ. Εικ. 2e) που ονομάζεται ΔNt-Tau.Η μικροσκοπία και η νεφελομετρία WF επιβεβαίωσαν ότι το ίδιο το ΔNt-Tau δεν υποβλήθηκε σε LLPS (Εικ. 2f και Συμπληρωματικό Σχήμα 2δ), όπως αναφέρθηκε προηγουμένως 14. Ωστόσο, όταν το αS προστέθηκε στα διαλύματα διασποράς αυτής της κολοβωμένης παραλλαγής Tau, η διαδικασία LLPS ήταν εντελώς αποκαταστάθηκε με πυκνότητα σταγονιδίων κοντά στην πυκνότητα σταγονιδίων διαλυμάτων πλήρους μεγέθους Tau και αS υπό παρόμοιες συνθήκες και συγκεντρώσεις πρωτεΐνης.Αυτή η διαδικασία μπορεί επίσης να παρατηρηθεί υπό συνθήκες χαμηλού μακρομοριακού συνωστισμού (Συμπληρωματικό Σχήμα 2γ).Ο ρόλος της C-τερματικής περιοχής αS, αλλά όχι ολόκληρου του μήκους της, στη διαδικασία LLPS αποδείχθηκε με την αναστολή του σχηματισμού σταγονιδίων χρησιμοποιώντας μια C-τερματική κολοβωμένη παραλλαγή αS χωρίς υπολείμματα 104-140 (Εικ. 1a) του (ΔCt- αS) πρωτεΐνη (Εικ. 2f και Συμπληρωματικό Σχ. 2δ).Ο εντοπισμός των αS και ΔNt-Tau επιβεβαιώθηκε με ομοεστιακή μικροσκοπία φθορισμού (Συμπληρωματικό Σχήμα 1β).
Για να ελεγχθεί περαιτέρω ο μηχανισμός LLPS μεταξύ Tau441 και αS, χρησιμοποιήθηκε μια πρόσθετη παραλλαγή Tau, δηλαδή το θραύσμα πυρήνα του ζευγαρωμένου ελικοειδούς νήματος (PHF) στην περιοχή σύνδεσης μικροσωληνίσκων (MTBD), η οποία εάν περιέχει τέσσερις χαρακτηριστικές επαναλαμβανόμενες περιοχές, κοινώς επίσης γνωστές ως το θραύσμα K18 (βλ. Εικ. 2e).Έχει πρόσφατα αναφερθεί ότι το αS δεσμεύεται κατά προτίμηση σε μια πρωτεΐνη ταυ που βρίσκεται σε μια περιοχή πλούσια σε προλίνη σε μια αλληλουχία που προηγείται της περιοχής δέσμευσης μικροσωληνίσκων.Ωστόσο, η περιοχή PHF είναι επίσης πλούσια σε θετικά φορτισμένα υπολείμματα (βλ. Εικόνα 2e), ειδικά λυσίνη (15% υπολείμματα), η οποία μας ώθησε να ελέγξουμε εάν αυτή η περιοχή συμβάλλει επίσης στη συμπύκνωση του συμπλέγματος αS/Tau.Παρατηρήσαμε ότι το K18 από μόνο του δεν μπορούσε να ενεργοποιήσει το LLPS σε συγκεντρώσεις έως και 100 μM υπό τις συνθήκες που δοκιμάστηκαν (ρυθμιστικό διάλυμα LLPS με 15% PEG ή 20% δεξτράνη) (Εικόνα 2στ).Ωστόσο, όταν προσθέσαμε 50 μΜ αS σε 50 μΜ Κ18, παρατηρήθηκε γρήγορος σχηματισμός σταγονιδίων πρωτεΐνης που περιέχουν Κ18 και αS με νεφελομετρία (Συμπληρωματικό Σχήμα 2δ) και μικροσκοπία WF (Εικ. 2στ).Όπως αναμενόταν, το ΔCt-αS δεν μπόρεσε να επαναφέρει τη συμπεριφορά LLPS του K18 (Εικ. 2f).Σημειώνουμε ότι η συσσωμάτωση αS/K18 απαιτεί ελαφρώς υψηλότερες συγκεντρώσεις πρωτεΐνης για την πρόκληση LLPS σε σύγκριση με το αS/ΔNt-Tau ή το αS/Tau441, ενώ άλλα πράγματα είναι ίσα.Αυτό είναι σύμφωνο με μια ισχυρότερη αλληλεπίδραση της αS C-τελικής περιοχής με την πλούσια σε προλίνη περιοχή Tau σε σύγκριση με την περιοχή δέσμευσης μικροσωληνίσκων, όπως περιγράφηκε προηγουμένως 31 .
Δεδομένου ότι το ΔNt-Tau δεν μπορεί να εκτελέσει LLPS απουσία αS, επιλέξαμε αυτήν την παραλλαγή Tau ως μοντέλο για τον χαρακτηρισμό του αS/Tau LLPS δεδομένης της απλότητάς του σε συστήματα LLPS με Tau πλήρους μήκους (ισότυπος, Tau441/Tau441).με πολύπλοκες (ετερότυπες, αS/Tau441) διαδικασίες συσσωμάτωσης.Συγκρίναμε τον βαθμό συσσωμάτωσης αS (ως μέρος της πρωτεΐνης συμπυκνωμένης φάσης, fαS,c) στα συστήματα αS/Tau και αS/ΔNt-Tau με φυγοκέντρηση και ανάλυση SDS-PAGE διασπαρμένης φάσης (βλ. 2e), βρήκαμε πολύ παρόμοιες τιμές για όλες τις πρωτεΐνες στην ίδια συγκέντρωση.Συγκεκριμένα, λάβαμε fαS,c 84 ± 2% και 79 ± 7% για αS/Tau και αS/ΔNt-Tau, αντίστοιχα, υποδηλώνοντας ότι η ετεροτυπική αλληλεπίδραση μεταξύ αS και tau είναι ανώτερη από την αλληλεπίδραση μεταξύ των μορίων tau.μεταξύ.
Η αλληλεπίδραση με διάφορα πολυκατιόντα και η επίδραση της διαδικασίας συμπύκνωσης στην κινητική του αS μελετήθηκαν αρχικά με τη μέθοδο ανάκτησης φθορισμού μετά τη φωτολεύκανση (FRAP).Δοκιμάσαμε αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau και αS/pLK coacervates (100 μM αS συμπληρωμένα με 2 μM αS AF488-αS και 100 μM Tau441 ή ΔNt-Tau ή 1 mM pLK).Τα δεδομένα ελήφθησαν μέσα στα πρώτα 30 λεπτά μετά την ανάμιξη των συστατικών του δείγματος.Από αντιπροσωπευτικές εικόνες FRAP (Εικ. 3a, συμπύκνωση αS/Tau441) και τις αντίστοιχες καμπύλες χρονικής πορείας τους (Εικ. 3β, Συμπληρωματικό Σχ. 3), μπορεί να φανεί ότι οι κινητικές αS είναι πολύ παρόμοιες με εκείνες των συνενώσεων Tau441.και ΔNt-Tau, που είναι πολύ πιο γρήγορο με το pLK.Οι υπολογισμένοι συντελεστές διάχυσης για το αS μέσα στο coacervate σύμφωνα με το FRAP (όπως περιγράφεται από τους Kang et al. 35) είναι D = 0,013 ± 0,009 μm2/s και D = 0,026 ± 0,008 μm2/s για το αS/Tau441 και αS/ το σύστημα αS/.pLK, Tau και D = 0,18 ± 0,04 μm2/s, αντίστοιχα (Εικ. 3c).Ωστόσο, ο συντελεστής διάχυσης αS στη διεσπαρμένη φάση είναι αρκετές τάξεις μεγέθους υψηλότερος από όλες τις συμπυκνωμένες φάσεις, όπως προσδιορίζεται από τη φασματοσκοπία συσχέτισης φθορισμού (FCS, βλέπε Συμπληρωματικό Σχήμα 3) υπό τις ίδιες συνθήκες (ρυθμιστικό διάλυμα LLPS) αλλά απουσία πολυκατιόντων (D = 8 ± 4 μm2/s).Ως εκ τούτου, η κινητική της μετάφρασης αS μειώνεται σημαντικά στα συνενώσεις σε σύγκριση με τις πρωτεΐνες στη διεσπαρμένη φάση λόγω των έντονων επιδράσεων μοριακού συνωστισμού, αν και όλα τα συσσωρευτικά διατηρούν ιδιότητες υγρές κατά την πρώτη μισή ώρα μετά τον σχηματισμό τους, σε αντίθεση με τη φάση ταυ.ταχύτερη κινητική στο συμπύκνωμα pLK.
a–c FRAP ανάλυση της δυναμικής αS (2% αS με σήμανση AF488) σε ηλεκτροστατικά κοψίματα.Αντιπροσωπευτικές εικόνες των δοκιμασιών αS/Tau441 FRAP εις τριπλούν φαίνονται στο (α), όπου οι κόκκινοι κύκλοι υποδεικνύουν αποχρωματισμένες περιοχές.Η γραμμή κλίμακας είναι 5 μm.β Μέσες καμπύλες FRAP και (γ) υπολογισμένοι συντελεστές διάχυσης (D) για 5–6 (N) διαφορετικά σταγονίδια από τρία πειράματα που χρησιμοποιούν 100 μM αS και ισομοριακές συγκεντρώσεις Tau441 (κόκκινο) ή ΔNt-Tau (μπλε) ή pLK (πράσινο) σε δεκαπλάσια συγκέντρωση του LLPS.Η τυπική απόκλιση της καμπύλης FRAP εμφανίζεται με σκιασμένο χρώμα.Για σύγκριση, ο συντελεστής διάχυσης αS στη διεσπαρμένη φάση προσδιορίστηκε εις τριπλούν χρησιμοποιώντας φασματοσκοπία συσχέτισης φθορισμού (FCS) (βλ. Συμπληρωματικό Σχήμα 3 και μεθόδους για περισσότερες πληροφορίες).d Συνεχή φάσματα EPR ζώνης X 100 μM TEMPOL-122-αS σε buffer LLPS χωρίς πολυκατιόν (μαύρο) ή παρουσία 100 μM Tau441 (κόκκινο) ή ΔNt-Tau (μπλε) ή 1 mM pLK (πράσινο).Το ένθετο δείχνει μια μεγεθυμένη άποψη των ισχυρών γραμμών πεδίου όπου συμβαίνουν οι πιο δραματικές αλλαγές.e Καμπύλες δέσμευσης 50 μM TEMPOL-122-αS με διάφορα πολυκατιόντα απουσία LLPS (χωρίς PEG).Το μειωμένο εύρος της ζώνης III σε σύγκριση με τη ζώνη II (IIII/III) του κανονικοποιημένου φάσματος EPR φαίνεται ότι αυξάνει τις μοριακές αναλογίες των Tau441 (κόκκινο), ΔNt-Tau (μπλε) και pLK (πράσινο).Οι έγχρωμες γραμμές δείχνουν προσαρμογή στα δεδομένα χρησιμοποιώντας ένα πρόχειρο μοντέλο δέσμευσης με n πανομοιότυπες και ανεξάρτητες θέσεις σύνδεσης σε κάθε καμπύλη.Τα ανεπεξέργαστα δεδομένα παρέχονται με τη μορφή αρχείων πρωτογενών δεδομένων.
Ως συμπλήρωμα, διερευνήσαμε τη δυναμική του αS σε διάφορα κοψίματα χρησιμοποιώντας επισήμανση κατευθυνόμενης περιστροφής (SDSL) και συνεχή παραμαγνητικό συντονισμό ηλεκτρονίων (CW-EPR).Αυτή η μέθοδος έχει αποδειχθεί πολύ χρήσιμη για την αναφορά της ευελιξίας και της δυναμικής του IDP με ρεαλιστική υπολειπόμενη ανάλυση36,37,38.Για το σκοπό αυτό, κατασκευάσαμε υπολείμματα κυστεΐνης σε μεμονωμένα μεταλλαγμένα Cys και χρησιμοποιήσαμε τον ανιχνευτή spin 4-υδροξυ-2,2,6,6-τετραμεθυλπιπεριδινο-Ν-οξυλίου (TEMPOL).Τα παράγωγα μαλεϊμιδίου τα επισημαίνουν.Πιο συγκεκριμένα, τοποθετήσαμε ανιχνευτές TEMPOL στη θέση 122 ή ​​24 αS (TEMPOL-122-αS και TEMPOL-24-αS).Στην πρώτη περίπτωση, στοχεύουμε την C-τερματική περιοχή της πρωτεΐνης, η οποία εμπλέκεται στην αλληλεπίδραση με τα πολυκατιόντα.Αντίθετα, η θέση 24 μπορεί να μας δώσει πληροφορίες για τη συνολική δυναμική των πρωτεϊνών στο συμπύκνωμα.Και στις δύο περιπτώσεις, τα σήματα EPR που ελήφθησαν για τις πρωτεΐνες της διεσπαρμένης φάσης αντιστοιχούσαν σε ρίζες νιτροξειδίου σε κατάσταση ταχείας κίνησης.Μετά από διαχωρισμό φάσης παρουσία tau ή pLK (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 ή ΔNt-Tau σε αναλογία 1:1 ή pLK σε αναλογία 1:10), παρατηρήθηκε αύξηση της σχετικής έντασης κορυφής σε το φάσμα EPR του αS.Η γραμμή απώλειας διευρύνθηκε, υποδεικνύοντας μειωμένη κινητική αναπροσανατολισμού αS στα σταγονίδια σε σύγκριση με την πρωτεΐνη σε αραιή φάση (Εικ. 3δ, Συμπληρωματικό Σχήμα 4α).Αυτές οι αλλαγές είναι πιο έντονες στη θέση 122. Ενώ στη θέση 24 η παρουσία του pLK δεν επηρέασε την κινητική του ανιχνευτή, στη θέση 122 το σχήμα της φασματικής γραμμής άλλαξε σημαντικά (Συμπληρωματικό Σχ. 4α).Όταν προσπαθήσαμε να μοντελοποιήσουμε τα φάσματα στη θέση 122 δύο συστημάτων αS/πολυκατιοποίησης χρησιμοποιώντας το ισοτροπικό μοντέλο (Συμπληρωματικό Σχήμα 5α) που χρησιμοποιείται συνήθως για να περιγράψει τη δυναμική του σημασμένου με spin IDP38,39, δεν μπορέσαμε να ανακατασκευάσουμε τα πειραματικά φάσματα..Φασματική προσομοίωση της θέσης των αντιθέσεων 24 περιστροφών (Συμπληρωματικό Σχ. 5α).Αυτό υποδηλώνει ότι υπάρχουν προνομιακές θέσεις στο χώρο των διαμορφώσεων σπιν της C-τερματικής περιοχής του αS παρουσία πολυκατιόντων.Όταν εξετάζεται το κλάσμα του αS στη συμπυκνωμένη φάση υπό πειραματικές συνθήκες EPR (84 ± 2%, 79 ± 7% και 47 ± 4% για τα αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau και αS/pLK, αντίστοιχα — βλέπε Συμπληρωματικό Εικ. 2e της ανάλυσης δεδομένων c), μπορεί να φανεί ότι η διεύρυνση που ανιχνεύεται με τη μέθοδο EPR αντανακλά κυρίως την αλληλεπίδραση της C-τερματικής περιοχής του αS με διάφορα πολυκατιόντα στη συμπυκνωμένη φάση (η κύρια αλλαγή κατά τη χρήση του TEMPOL-122- αS), και όχι συμπύκνωση πρωτεΐνης.Παρατηρείται αύξηση στο μικροϊξώδες στον ανιχνευτή.Όπως αναμενόταν, το φάσμα EPR της πρωτεΐνης υπό συνθήκες διαφορετικές από το LLPS αποκαταστάθηκε πλήρως όταν προστέθηκε 1 Μ NaCl στο μίγμα (Συμπληρωματικό Σχήμα 4b).Συνολικά, τα δεδομένα μας υποδηλώνουν ότι οι αλλαγές που ανιχνεύονται από το CW-EPR αντικατοπτρίζουν κυρίως την αλληλεπίδραση της C-τερματικής περιοχής του αS με διάφορα πολυκατιόντα στη συμπυκνωμένη φάση και αυτή η αλληλεπίδραση φαίνεται να είναι ισχυρότερη με το pLK παρά με το Tau.
Προκειμένου να λάβουμε περισσότερες δομικές πληροφορίες σχετικά με τις πρωτεΐνες στο coacervate, αποφασίσαμε να μελετήσουμε το σύστημα LLPS χρησιμοποιώντας NMR σε διάλυμα.Ωστόσο, μπορούσαμε να ανιχνεύσουμε μόνο το κλάσμα αS που παραμένει στη διεσπαρμένη φάση, το οποίο μπορεί να οφείλεται στη μειωμένη δυναμική της πρωτεΐνης μέσα στο συσσωρευτή και σε μια πυκνή φάση στο κάτω μέρος του διαλύματος στην ανάλυση NMR.Όταν αναλύσαμε τη δομή και τη δυναμική της πρωτεΐνης που παραμένει στη διεσπαρμένη φάση του δείγματος LLPS χρησιμοποιώντας NMR (Συμπληρωματικό Σχήμα 5c, d), παρατηρήσαμε ότι η πρωτεΐνη συμπεριφέρθηκε σχεδόν πανομοιότυπα παρουσία pLK και ΔNt-Tau, και των δύο που ήταν σε δευτερογενή δομή και δυναμική της πρωτεϊνικής ραχοκοκαλιάς, που αποκαλύφθηκε από πειράματα για δευτερογενή χημική μετατόπιση και χαλάρωση R1ρ.Τα δεδομένα NMR δείχνουν ότι το καρβοξυτελικό άκρο του αS υφίσταται σημαντική απώλεια διαμορφωτικής ευελιξίας ενώ διατηρεί τη διαταραγμένη φύση του, όπως η υπόλοιπη αλληλουχία πρωτεΐνης, λόγω των αλληλεπιδράσεών του με τα πολυκατιόντα.
Δεδομένου ότι η διεύρυνση του σήματος CW-EPR που παρατηρήθηκε στη συμπυκνωμένη φάση TEMPOL-122-αS αντανακλά την αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης με τα πολυκατιόντα, πραγματοποιήσαμε μια τιτλοδότηση EPR για να αξιολογήσουμε τη συγγένεια δέσμευσης του αS σε διάφορα πολυκατιόντα απουσία LLPS (χωρίς συσσώρευση Buffer LLPS), υποδηλώνοντας ότι οι αλληλεπιδράσεις είναι ίδιες σε αραιές και συμπυκνωμένες φάσεις (κάτι που επιβεβαιώνεται από τα δεδομένα μας, Συμπληρωματικό Σχ. 4α και Συμπληρωματικό Σχ. 6).Ο στόχος ήταν να διαπιστωθεί εάν όλα τα συσσωρευμένα, παρά τις κοινές ιδιότητές τους που μοιάζουν με υγρά, εμφανίζουν κάποια υποκείμενη διαφορική συμπεριφορά σε μοριακό επίπεδο.Όπως αναμενόταν, το φάσμα EPR διευρύνθηκε με την αύξηση της συγκέντρωσης πολυκατιόντος, αντανακλώντας μια μείωση στη μοριακή ευελιξία λόγω των μοριακών αλληλεπιδράσεων όλων των εταίρων αλληλεπίδρασης σχεδόν μέχρι κορεσμού (Εικ. 3e, Συμπληρωματικό Σχ. 6).Το pLK πέτυχε αυτόν τον κορεσμό σε χαμηλότερη μοριακή αναλογία (πολυκατίωση:αS) σε σύγκριση με τα ΔNt-Tau και Tau441.Στην πραγματικότητα, η σύγκριση των δεδομένων με ένα κατά προσέγγιση μοντέλο δέσμευσης υποθέτοντας n πανομοιότυπες και ανεξάρτητες θέσεις δέσμευσης έδειξε ότι η φαινομενική σταθερά διάστασης του pLK (~5 μM) είναι μια τάξη μεγέθους χαμηλότερη από αυτή του Tau441 ή του ΔNt-Tau (~50 μM ).μΜ).Αν και αυτή είναι μια πρόχειρη εκτίμηση, αυτό υποδηλώνει ότι το αS έχει υψηλότερη συγγένεια για απλούστερα πολυκατιόντα με περιοχές συνεχούς θετικού φορτίου.Δεδομένης αυτής της διαφοράς στη συγγένεια μεταξύ του αS και των διαφόρων πολυκατιόντων, υποθέσαμε ότι οι υγρές τους ιδιότητες μπορεί να αλλάξουν διαφορετικά με την πάροδο του χρόνου και επομένως να υποφέρουν από διαφορετικές διαδικασίες LSPT.
Δεδομένου του εξαιρετικά συνωστισμένου περιβάλλοντος εντός του πρωτεϊνικού coacervate και της αμυλοειδούς φύσης της πρωτεΐνης, παρατηρήσαμε τη συμπεριφορά του coacervate με την πάροδο του χρόνου για να ανιχνεύσουμε πιθανές διεργασίες LSPT.Χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο BF και CF (Εικόνα 4), παρατηρήσαμε ότι το αS/Tau441 συγχωνεύεται σε μεγάλο βαθμό σε διάλυμα, σχηματίζοντας μεγάλα σταγονίδια που έρχονται σε επαφή και διαβρέχουν την επιφάνεια στον πυθμένα του φρεατίου/ολισθαίνει ως πλήρη σταγονίδια, όπως αναμενόταν (Συμπληρωματικό Σχ. 7d);ονομάζουμε αυτές τις δομές που σχηματίζονται από τον πυθμένα "σχεδίες πρωτεΐνης".Αυτές οι δομές παρέμειναν ρευστές καθώς διατήρησαν την ικανότητα σύντηξης (Συμπληρωματικό Σχ. 7β) και μπορούσαν να φανούν για αρκετές ώρες μετά την ενεργοποίηση του LLPS (Εικ. 4 και Συμπληρωματικό Σχ. 7γ).Παρατηρήσαμε ότι η διαδικασία διαβροχής ευνοείται στην επιφάνεια των υδρόφιλων και όχι των υδρόφοβων υλικών (Συμπληρωματικό Σχ. 7α), όπως αναμένεται για ηλεκτροστατικές συνενώσεις με μη ισορροπημένα φορτία και επομένως υψηλά ηλεκτροστατικά επιφανειακά δυναμικά.Συγκεκριμένα, η συνένωση αS/ΔNt-Tau και το rafting μειώθηκαν σημαντικά, ενώ τα συμπυκνώματα αS/pLK μειώθηκαν σημαντικά (Εικ. 4).Κατά τη διάρκεια του σύντομου χρόνου επώασης, τα σταγονίδια αS/pLK μπόρεσαν να συνενωθούν και να διαβρέξουν την υδρόφιλη επιφάνεια, αλλά αυτή η διαδικασία σταμάτησε γρήγορα και μετά από 5 ώρες επώασης, παρατηρήθηκαν μόνο περιορισμένα συμβάντα συνένωσης και καμία διαβροχή.– μετάβαση σε τζελ-στάγδην.
Αντιπροσωπευτικά BF (πίνακες κλίμακας του γκρι) και CF (δεξιά πλαίσια, αS με σήμανση AF488 με πράσινο χρώμα) συγχωνευμένων δειγμάτων που περιέχουν 100 μM αS (1% φθορίζουσα ετικέτα) σε ρυθμιστικό διάλυμα LLPS παρουσία 100 μM Tau441 (επάνω) μικροσκοπικές εικόνες φθορισμού) -Tau (κέντρο) ή 1 mM pLK (κάτω) σε διαφορετικούς χρόνους επώασης και εστιακά ύψη (z, απόσταση από το κάτω μέρος του φρεατίου της πλάκας).Τα πειράματα επαναλήφθηκαν 4-6 φορές ανεξάρτητα το ένα από το άλλο με τα ίδια αποτελέσματα.Τα coacervates αS/Tau441 διαβρέχονται μετά από 24 ώρες, σχηματίζοντας σχεδίες μεγαλύτερες από την εικόνα.Η γραμμή κλίμακας για όλες τις εικόνες είναι 20 μm.
Στη συνέχεια ρωτήσαμε εάν οι μεγάλες δεξαμενές πρωτεΐνης που μοιάζουν με υγρό που σχηματίζονται στο αS/Tau441 LLPS θα οδηγούσαν σε συσσωμάτωση αμυλοειδούς οποιασδήποτε από τις πρωτεΐνες που μελετήθηκαν.Παρακολουθήσαμε την ωρίμανση των σταγονιδίων αS/Tau441 με την πάροδο του χρόνου με μικροσκόπιο WF υπό τις ίδιες συνθήκες όπως παραπάνω, αλλά χρησιμοποιώντας αS με σήμανση AF488 1 μΜ και Tau441 με σήμανση Atto647N (Εικ. 5α).Όπως ήταν αναμενόμενο, παρατηρήσαμε πλήρη εντοπισμό πρωτεΐνης σε όλη τη διαδικασία ωρίμανσης.Είναι ενδιαφέρον ότι από περίπου.Μετά από 5 ώρες, παρατηρήθηκαν πιο έντονες μη κυκλικές δομές στο εσωτερικό των σχεδιών, τις οποίες ονομάσαμε «σημεία», μερικές από τις οποίες εντοπίστηκαν με αS και μερικές εμπλουτίστηκαν σε Tau441 (Εικ. 5α, λευκά βέλη).Αυτές οι κηλίδες παρατηρήθηκαν πάντα μέσα σε σχεδίες σε μεγαλύτερο βαθμό για το αS/ΔNt-Tau παρά για το αS/ΔNt-Tau.Δεν υπήρχαν διακριτές κηλίδες στα σταγονίδια των συστημάτων pLK και Tau ανίκανων για σύντηξη/διαβροχή.Για να ελέγξουμε εάν αυτές οι κηλίδες που περιέχουν αS και Tau441 είναι συσσωματώματα που μοιάζουν με αμυλοειδές, πραγματοποιήσαμε ένα παρόμοιο πείραμα χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο CF στο οποίο το Tau441 επισημάνθηκε με Atto647N και προστέθηκε από την αρχή 12,5 μM ειδική για το αμυλοειδές θειοφλαβίνη-Τ (ThT).βαφή.Αν και η χρώση με ThT σταγονιδίων ή σχεδιών αS/Tau441 δεν παρατηρήθηκε ακόμη και μετά από 24 ώρες επώασης (Εικ. 5β, πάνω σειρά - εναπομείναντα σταγονίδια πάνω από σχεδίες πρωτεΐνης), οι ThT-θετικές δομές που περιείχαν Atto647N-Tau441 μέσα στις σχεδίες ήταν πολύ αδύναμες.Αυτό αναπαράγει το μέγεθος, το σχήμα και τη θέση των κηλίδων που περιγράφηκαν προηγουμένως (Εικ. 5β, μεσαίες και κάτω σειρές), υποδηλώνοντας ότι οι κηλίδες μπορεί να αντιστοιχούν σε συσσωματώματα που μοιάζουν με αμυλοειδές που σχηματίζονται σε γήρανση υγρών συσσωρευτών.
WF 25 μM αS σε διάφορους χρόνους επώασης και εστιακά ύψη (z, απόσταση από τον αδέσμευτο πυθμένα) παρουσία 25 μM Tau441 (1 μM αS με σήμανση AF488 και Tau441 με σήμανση Atto647N) σε ένα φρεάτιο μιας πλάκας μικροσκοπίου με ρυθμιστικό διάλυμα LLPS) .Έξι πειράματα επαναλήφθηκαν ανεξάρτητα με παρόμοια αποτελέσματα.b Μικροσκοπική εικόνα CF 25 μM αS παρουσία 25 μM Tau441 (1 μΜ σημασμένο με Atto647N Tau441) και 12,5 μΜ θειοφλαβίνης-Τ (ThT).Τα σταθμισμένα σταγονίδια πρωτεΐνης και οι σχεδίες και οι κηλίδες εναποτιθέμενης πρωτεΐνης εμφανίζονται στην επάνω και στη μεσαία σειρά, αντίστοιχα.Η κάτω σειρά δείχνει εικόνες σχεδίων και πτώσεων από 3 ανεξάρτητα αντίγραφα.Τα λευκά βέλη υποδεικνύουν κουκκίδες θετικές ThT και στα δύο πλαίσια.Η γραμμή κλίμακας για όλες τις εικόνες είναι 20 μm.
Για να εξετάσουμε λεπτομερέστερα τις αλλαγές στο δίκτυο της πρωτεΐνης coacervate κατά τη μετάβαση από υγρό σε στερεό, χρησιμοποιήσαμε απεικόνιση φθορισμού διάρκειας ζωής (FLIM) και μικροσκόπιο μεταφοράς ενέργειας συντονισμού Förster (FRET) (Εικόνα 6 και συμπληρωματικά σχήματα 8 και 9).Υποθέσαμε ότι η ομοιογενής ωρίμανση του στρώματος σε μια πιο συμπυκνωμένη ή ακόμη και σαν στερεά δομή συσσωματωμένης πρωτεΐνης οδηγεί σε στενότερη επαφή μεταξύ της πρωτεΐνης και του φθορίζοντος ανιχνευτή που είναι προσαρτημένος σε αυτήν, δυνητικά παράγοντας ένα αποτέλεσμα σβέσης που εκδηλώνεται σε μια συντομευμένη διάρκεια ζωής ανιχνευτή (τ) , όπως περιγράφηκε προηγουμένως40.,41 ,42.Επιπλέον, για δείγματα διπλής σήμανσης (AF488 και Atto647N ως βαφές δότη και δέκτη FRET, αντίστοιχα), αυτή η μείωση στο τ μπορεί επίσης να συνοδεύεται από συμπύκνωση συμπύκνωσης και αύξηση της απόδοσης FRET(E) κατά τη διάρκεια του LSPT.Παρακολουθήσαμε το σχηματισμό σχεδίων και κηλίδων με την πάροδο του χρόνου σε δείγματα LLPS αS/Tau441 και αS/ΔNt-Tau (25 μΜ από κάθε πρωτεΐνη σε ρυθμιστικό διάλυμα LLPS που περιέχει 1 μΜ AF488 επισημασμένο με αS και/ή Atto647N με επισήμανση Tau441 ή ΔNt-Tau).Παρατηρήσαμε μια γενική τάση στο ότι η διάρκεια ζωής φθορισμού των ανιχνευτών AF488 (τ488) και Atto647N (τ647Ν) μειώθηκε ελαφρά καθώς ωρίμαζαν τα κοψίματα (Εικ. 6 και Συμπληρωματικό Σχήμα 8γ).Είναι ενδιαφέρον ότι αυτή η αλλαγή ενισχύθηκε σημαντικά για τις κουκκίδες μέσα σε σχεδίες (Εικ. 6c), υποδεικνύοντας ότι περαιτέρω συμπύκνωση πρωτεΐνης σημειώθηκε στις κουκκίδες.Προς υποστήριξη αυτού, δεν παρατηρήθηκε σημαντική αλλαγή στη διάρκεια ζωής του φθορισμού για σταγονίδια αS/ΔNt-Tau ηλικίας για 24 ώρες (Συμπληρωματικό Σχήμα 8δ), υποδηλώνοντας ότι η ζελατινοποίηση σταγονιδίων είναι μια διαδικασία διαφορετική από την κηλίδωση και που δεν συνοδεύεται από σημαντική μοριακή αναδιοργάνωση εντός κοακερβών.Πρέπει να σημειωθεί ότι οι τελείες έχουν διαφορετικά μεγέθη και μεταβλητό περιεχόμενο σε αS, ειδικά για το σύστημα αS/Tau441 (Συμπληρωματικό Σχ. 8ε).Η μείωση στη διάρκεια ζωής του σημειακού φθορισμού συνοδεύτηκε από αύξηση της έντασης, ειδικά για το Tau441 με σήμανση Atto647N (Συμπληρωματικό Σχήμα 8a) και υψηλότερες αποδόσεις FRET και για τα συστήματα αS/Tau441 και αS/ΔNt-Tau, υποδεικνύοντας περαιτέρω συμπύκνωση σε LLPS πέντε ώρες μετά την ενεργοποίηση, οι πρωτεΐνες μέσα στον στατικό ηλεκτρισμό συμπυκνώθηκαν.Σε σύγκριση με το αS/ΔNt-Tau, παρατηρήσαμε χαμηλότερες τιμές τ647N και κάπως υψηλότερες τιμές τ488 σε σημεία αS/Tau441, συνοδευόμενες από χαμηλότερες και πιο ανομοιογενείς τιμές FRET.Πιθανώς, αυτό μπορεί να σχετίζεται με το γεγονός ότι στο σύστημα αS/Tau441, η παρατηρούμενη και αναμενόμενη αφθονία αS σε συσσωματώματα είναι πιο ετερογενής, συχνά υποστοιχειομετρική σε σύγκριση με το Tau, καθώς το ίδιο το Tau441 μπορεί επίσης να υποστεί LLPS και συσσωμάτωση (Συμπληρωματικό Σχήμα 8e) .Ωστόσο, ο βαθμός συνένωσης σταγονιδίων, ο σχηματισμός σχεδίας και, σημαντικότερα, η συσσώρευση πρωτεϊνών μέσα σε υγρό-όμοια κοψίματα είναι μέγιστος όταν υπάρχουν και τα Tau441 και αS.
εικόνες μικροσκοπίας φθορισμού εφ' όρου ζωής (FLIM) των αS/Tau441 και αS/ΔNt-Tau στα 25 μM κάθε πρωτεΐνης (1 μΜ αS με σήμανση AF488 και 1 μΜ σημασμένο με Atto647N Tau441 ή ΔNt-Tau) σε ρυθμιστικό διάλυμα LLPS.Οι στήλες δείχνουν αντιπροσωπευτικές εικόνες δειγμάτων LLPS σε διαφορετικούς χρόνους ωρίμανσης (30 λεπτά, 5 ώρες και 24 ώρες).Το κόκκινο πλαίσιο δείχνει την περιοχή που περιέχει κηλίδες αS/Tau441.Η διάρκεια ζωής εμφανίζεται ως έγχρωμες γραμμές.Γραμμή κλίμακας = 20 μm για όλες τις εικόνες.b Μεγέθυνση εικόνας FLIM της επιλεγμένης περιοχής, που εμφανίζεται στο κόκκινο πλαίσιο στον πίνακα α.Τα εύρη ζωής εμφανίζονται χρησιμοποιώντας την ίδια χρωματική κλίμακα όπως στον πίνακα α.Μπάρα κλίμακας = 5 μm.γ Ιστογράμματα που δείχνουν AF488 (συνδεδεμένο με αS) ή Atto647N (συνδεδεμένο με Tau) για διαφορετικά είδη πρωτεϊνών (σταγονίδια-D-, raft-R- και speckle-P) που προσδιορίζονται σε εικόνες FLIM που καταγράφηκαν για αS-) κατανομή χρονισμού διάρκεια ζωής του Tau441 και Δείγματα αS/ΔNt-Tau coacervate (N = 17-32 ROI για το D, 29-44 ROI για το R και 21-51 ROI για τα σημεία).Οι μέσες και διάμεσες τιμές εμφανίζονται ως κίτρινα τετράγωνα και μαύρες γραμμές μέσα στα πλαίσια, αντίστοιχα.Το κάτω και το άνω όριο του πλαισίου αντιπροσωπεύουν το πρώτο και το τρίτο τεταρτημόριο, αντίστοιχα, και οι ελάχιστες και μέγιστες τιμές εντός του 1,5-πλάσιου διατεταρτημορίου εύρους (IQR) εμφανίζονται ως μουστάκια.Τα ακραία σημεία εμφανίζονται ως μαύρα διαμάντια.Η στατιστική σημασία μεταξύ των ζευγών κατανομών προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα τεστ t δύο δειγμάτων, υποθέτοντας άνισες διακυμάνσεις.Οι τιμές p της δοκιμής t δύο ουρών εμφανίζονται με αστερίσκους για κάθε ζεύγος συγκριτικών δεδομένων (* p-value > 0,01, ** p-value > 0,001, *** p-value > 0,0001, **** p-value > 0,00001), ns Υποδεικνύει αμελητέα (p-value > 0,05).Οι ακριβείς τιμές p δίνονται στον Συμπληρωματικό Πίνακα 1 και τα αρχικά δεδομένα παρουσιάζονται ως μη επεξεργασμένα αρχεία δεδομένων.
Για να δείξουμε περαιτέρω τη φύση των κηλίδων/συσσωματωμάτων που μοιάζουν με αμυλοειδές, επεξεργάσαμε μη χρωματισμένα δείγματα συνενώσεων για 24 ώρες με υψηλές συγκεντρώσεις (1 Μ) NaCl, που οδήγησαν στον διαχωρισμό των συσσωματωμάτων από πρωτεϊνικά συσσωμάτωμα.Όταν απομονωμένα συσσωματώματα (δηλ. ένα διάσπαρτο διάλυμα αδρανών) παρατηρήθηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκοπία ατομικής δύναμης (AFM), παρατηρήσαμε μια κυρίως σφαιρική μορφολογία με κανονικό ύψος περίπου 15 nm, η οποία τείνει να συσχετίζεται υπό συνθήκες υψηλής συγκέντρωσης άλατος, παρόμοια με τη συμπεριφορά των τυπικών ινιδίων αμυλοειδούς λόγω της ισχυρής υδρόφοβης επίδρασης στην επιφάνεια (σημειώστε ότι τα ινίδια έχουν τυπικά ύψος ~10 nm) (Συμπληρωματικό Σχ. 10α).Είναι ενδιαφέρον ότι όταν τα απομονωμένα συσσωματώματα επωάστηκαν με ThT σε μια τυπική δοκιμασία φθορισμού ThT, παρατηρήσαμε μια δραματική αύξηση στην κβαντική απόδοση φθορισμού ThT, συγκρίσιμη με αυτή που παρατηρήθηκε όταν η βαφή επωάστηκε με τυπικά ινίδια αμυλοειδούς αS (Συμπληρωματικό Σχήμα 10). Τα συνενωμένα συσσωματώματα περιέχουν δομές που μοιάζουν με αμυλοειδές..Στην πραγματικότητα, τα συσσωματώματα ήταν ανεκτικά σε υψηλές συγκεντρώσεις άλατος αλλά ευαίσθητα σε χλωριούχο γουανιδίνη 4 Μ (GdnHCl), όπως τα τυπικά ινίδια αμυλοειδούς (Συμπληρωματικό Σχήμα 10γ).
Στη συνέχεια, αναλύσαμε τη σύνθεση των συσσωματωμάτων χρησιμοποιώντας φθορισμό ενός μορίου, ειδική φασματοσκοπία συσχέτισης/διασταυρούμενης συσχέτισης φθορισμού (FCS/FCCS) και ανάλυση ριπής ανίχνευσης σύμπτωσης δύο χρωμάτων (TCCD).Για το σκοπό αυτό, απομονώσαμε συσσωματώματα που σχηματίστηκαν μετά από 24 ώρες επώασης σε δείγματα 100 μl LLPS που περιείχαν αS και Tau441 (και τα δύο 25 μM) μαζί με 1 μΜ αS με σήμανση AF488 και 1 μΜ σημασμένο με Atto647N Tau441.Αραιώστε το προκύπτον διεσπαρμένο διάλυμα συσσωματώματος σε μονομοριακή κατάσταση χρησιμοποιώντας το ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα χωρίς PEG και 1 M NaCl (το ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα που χρησιμοποιείται για τον διαχωρισμό των συσσωματωμάτων από το συσσωμάτωμα) για να αποτρέψετε τυχόν ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ LLPS και πρωτεΐνης.Ένα παράδειγμα της χρονικής τροχιάς ενός μόνο μορίου μπορεί να φανεί στο Σχ. 7α.Η ανάλυση FCCS/FCS (διασταυρούμενη συσχέτιση, CC και αυτοσυσχέτιση, AC) έδειξε ότι τα συσσωματώματα που περιείχαν αS και tau ήταν άφθονα στα δείγματα (βλ. καμπύλη CC στο Σχ. 7β, αριστερό πλαίσιο) και προέκυψε περίσσεια υπολειμματικής μονομερικής πρωτεΐνης ως αποτέλεσμα της διαδικασίας αραίωσης (βλ. καμπύλες AC στο Σχήμα 7β, αριστερό πλαίσιο).Τα πειράματα ελέγχου που πραγματοποιήθηκαν υπό τις ίδιες συνθήκες διαλύματος χρησιμοποιώντας δείγματα που περιείχαν μόνο μονομερείς πρωτεΐνες δεν έδειξαν καμπύλες CC και οι καμπύλες AC ταιριάζουν καλά με το μοντέλο διάχυσης ενός συστατικού (Εξ. 4), όπου οι μονομερείς πρωτεΐνες έχουν τους αναμενόμενους συντελεστές διάχυσης (Εικ. 7β ), δεξιός πίνακας).Ο συντελεστής διάχυσης των συσσωματωμένων σωματιδίων είναι μικρότερος από 1 μm2/s και αυτός των μονομερών πρωτεϊνών είναι περίπου 1 μm2/s.50–100 µm/s;Οι τιμές είναι παρόμοιες με τις προηγουμένως δημοσιευμένες τιμές για ινίδια αμυλοειδούς αS που έχουν υποστεί επεξεργασία με υπερήχους και για μονομερή αS ξεχωριστά υπό παρόμοιες συνθήκες διαλύματος44.Όταν αναλύσαμε τα συσσωματώματα με ανάλυση έκρηξης TCCD (Εικ. 7γ, επάνω πλαίσιο), βρήκαμε ότι σε κάθε απομονωμένο συσσωμάτωμα (ετεροσυσσωματώματα αS/Tau), περίπου το 60% των ανιχνευθέντων αδρανών περιείχε και αS και ταυ, περίπου το 30% περιείχε μόνο tau, περίπου 10% αS μόνο.Η στοιχειομετρική ανάλυση των ετεροσυσσωματωμάτων αS/Tau έδειξε ότι τα περισσότερα από τα ετεροσυσσωματώματα ήταν εμπλουτισμένα σε tau (στοιχειομετρία κάτω από 0,5, ο μέσος αριθμός μορίων tau ανά συσσωμάτωμα είναι 4 φορές μεγαλύτερος από τα μόρια αS), κάτι που είναι σύμφωνο με την εργασία μας που παρατηρήθηκε στο FLIM in situ πειράματα..Η ανάλυση FRET έδειξε ότι αυτά τα συσσωματώματα περιείχαν και τις δύο πρωτεΐνες, αν και οι πραγματικές τιμές FRET σε αυτή την περίπτωση δεν έχουν μεγάλη σημασία, καθώς η κατανομή των φθοροφόρων σε κάθε συσσωμάτωμα ήταν τυχαία λόγω περίσσειας μη επισημασμένης πρωτεΐνης που χρησιμοποιήθηκε στο πείραμα.Είναι ενδιαφέρον ότι όταν πραγματοποιήσαμε την ίδια ανάλυση χρησιμοποιώντας την παραλλαγή Tau με ανεπάρκεια συσσωματώσεως αμυλοειδούς 45,46 (βλ. Συμπληρωματικό Σχήμα 11a,b), παρατηρήσαμε ότι παρόλο που η ηλεκτροστατική συσσωμάτωση αS ήταν η ίδια (Συμπληρωματικό Σχήμα 11c, d), η ικανότητα σχηματισμού συσσωματωμάτων εντός του συσσωρευτή μειώθηκε δραστικά και το FLIM ανίχνευσε αρκετές κηλίδες σε in situ πειράματα και παρατηρήθηκαν ασθενείς καμπύλες διασταυρούμενης συσχέτισης για μεμονωμένα συσσωματωμένα δείγματα.Ωστόσο, για έναν μικρό αριθμό ανιχνευθέντων συσσωματωμάτων (μόνο το ένα δέκατο του Tau441), παρατηρήσαμε ότι κάθε συσσωμάτωμα ήταν εμπλουτισμένο σε αS από αυτήν την παραλλαγή Tau, με περίπου το 50% των ανιχνευθέντων συσσωματωμάτων να περιέχουν μόνο μόρια αS και το αS ήταν ετερογενές σε περίσσεια .αδρανή (βλ. Συμπληρωματικό Σχ. 11ε), σε αντίθεση με τα ετερογενή συσσωματώματα που παράγονται από το Tau441 (Εικ. 6στ).Τα αποτελέσματα αυτών των πειραμάτων έδειξαν ότι αν και το ίδιο το αS είναι ικανό να συσσωρεύεται με ταυ μέσα στο συσσωρευτή, η πυρήνωση ταυ είναι πιο ευνοϊκή υπό αυτές τις συνθήκες και τα προκύπτοντα συσσωματώματα που μοιάζουν με αμυλοειδές μπορούν να δρουν ως μια μορφή αS και ταυ.Ωστόσο, από τη στιγμή που σχηματίζεται ένας πλούσιος σε ταυ πυρήνας, οι ετεροτυπικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ αS και ταυ ευνοούνται σε συσσωματώματα έναντι των ομοτυπικών αλληλεπιδράσεων μεταξύ μορίων ταυ.παρατηρούμε επίσης πρωτεϊνικά δίκτυα σε υγρά αS/tau coacervates.
α Αντιπροσωπευτικά χρονικά ίχνη φθορισμού μεμονωμένων μορίων απομονωμένων συσσωματωμάτων που σχηματίζονται σε ηλεκτροστατικά συνενώσεις αS/Tau441.Εκρήξεις που αντιστοιχούν σε συσσωματώματα αS/Tau441 (εκρήξεις πάνω από το υποδεικνυόμενο όριο) παρατηρήθηκαν σε τρία κανάλια ανίχνευσης (εκπομπή AF488 και Atto647N μετά από άμεση διέγερση, μπλε και κόκκινες γραμμές, εκπομπή Atto647N μετά από έμμεση διέγερση), FRET, βιολετί γραμμή).b Ανάλυση FCS/FCCS ενός δείγματος απομονωμένων συσσωματωμάτων αS/Tau441 που ελήφθη από το LLPS (αριστερό πλαίσιο).Οι καμπύλες αυτοσυσχέτισης (AC) για τα AF488 και Atto647N εμφανίζονται με μπλε και κόκκινο, αντίστοιχα, και οι καμπύλες διασταυρούμενης συσχέτισης (CC) που σχετίζονται με συσσωματώματα που περιέχουν και τις δύο βαφές εμφανίζονται με μωβ.Οι καμπύλες AC αντικατοπτρίζουν την παρουσία επισημασμένων μονομερών και συσσωματωμένων πρωτεϊνικών ειδών, ενώ οι καμπύλες CC δείχνουν μόνο τη διάχυση διπλά επισημασμένων συσσωματωμάτων.Η ίδια ανάλυση, αλλά υπό τις ίδιες συνθήκες διαλύματος όπως σε απομονωμένα σημεία, τα δείγματα που περιέχουν μόνο μονομερή αS και Tau441 εμφανίζονται ως μάρτυρες στο δεξιό πλαίσιο.c Ανάλυση φλας φθορισμού μεμονωμένων μορίων απομονωμένων συσσωματωμάτων που σχηματίζονται σε ηλεκτροστατικά συνενώσεις αS/Tau441.Οι πληροφορίες για κάθε άθροισμα που βρίσκεται σε τέσσερις διαφορετικές επαναλήψεις (N = 152) σχεδιάζονται σε συνάρτηση με τη στοιχειομετρία, τις τιμές S και την αποτελεσματικότητα FRET (πάνω πάνελ, γραμμή χρώματος αντικατοπτρίζει την εμφάνιση).Τρεις τύποι αδρανών μπορούν να διακριθούν: -αS-μόνο συσσωματώματα με S~1 και FRET~0, συσσωματώματα μόνο Tau με S~0 και FRET~1 και ετερογενή συσσωματώματα Tau/αS με ενδιάμεσο S και FRET Εκτιμήσεις του ποσού και των δύο πρωτεϊνών δείκτη που ανιχνεύονται σε κάθε ετερογενές συσσωμάτωμα (N = 100) εμφανίζονται στο κάτω πλαίσιο (η χρωματική κλίμακα αντικατοπτρίζει την εμφάνιση).Τα ανεπεξέργαστα δεδομένα παρέχονται με τη μορφή αρχείων πρωτογενών δεδομένων.
Η ωρίμανση ή η γήρανση των υγρών πρωτεϊνικών συμπυκνωμάτων σε δομές που μοιάζουν με γέλη ή στερεές με την πάροδο του χρόνου έχει αναφερθεί ότι εμπλέκεται σε διάφορες φυσιολογικές λειτουργίες του συμπυκνώματος47 καθώς και σε ασθένειες, ως μια ανώμαλη διαδικασία που προηγείται της συσσωμάτωσης αμυλοειδούς 7, 48, 49. Εδώ μελετάμε λεπτομερώς τον διαχωρισμό φάσεων και τη συμπεριφορά.LSPT αS παρουσία τυχαίων πολυκατιόντων σε ελεγχόμενο περιβάλλον σε χαμηλές μικρομοριακές συγκεντρώσεις και φυσιολογικά σχετικές συνθήκες (σημειώστε ότι η υπολογιζόμενη φυσιολογική συγκέντρωση του αS είναι >1 μΜ50), ακολουθώντας την τυπική θερμοδυναμικά καθοδηγούμενη συμπεριφορά του LPS.Βρήκαμε ότι το αS, το οποίο περιέχει μια εξαιρετικά αρνητικά φορτισμένη C-τερματική περιοχή σε φυσιολογικό pH, είναι σε θέση να σχηματίσει σταγονίδια πλούσια σε πρωτεΐνες σε υδατικό διάλυμα μέσω LLPS παρουσία υψηλά κατιονικών διαταραγμένων πεπτιδίων όπως pLK ή Tau μέσω της διαδικασίας ηλεκτροστατικής σύνθετη συμπύκνωση παρουσία μακρομορίων συσσωμάτωσης.Αυτή η διαδικασία μπορεί να έχει σχετικές επιδράσεις στο κυτταρικό περιβάλλον όπου το αS συναντά διάφορα πολυκατιονικά μόρια που σχετίζονται με τη συσσωμάτωση που σχετίζεται με την ασθένεια τόσο in vitro όσο και in vivo51,52,53,54.
Σε πολλές μελέτες, η δυναμική των πρωτεϊνών μέσα στα σταγονίδια έχει θεωρηθεί ως ένας από τους βασικούς παράγοντες που καθορίζουν τη διαδικασία ωρίμανσης55,56.Στα ηλεκτροστατικά αS με πολυκατιόντα, η διαδικασία ωρίμανσης εξαρτάται προφανώς από την ισχύ των αλληλεπιδράσεων με τα πολυκατιόντα, το σθένος και την πολλαπλότητα αυτών των αλληλεπιδράσεων.Η θεωρία ισορροπίας προτείνει ότι ένα τοπίο ισορροπίας δύο υγρών καταστάσεων θα ήταν η παρουσία ενός μεγάλου σταγονιδίου πλούσιου σε βιοπολυμερή που οδηγούν το LLPS57,58.Η ανάπτυξη σταγονιδίων μπορεί να επιτευχθεί με ωρίμανση Ostwald59, συνένωση60 ή κατανάλωση ελεύθερου μονομερούς στη διασπαρμένη φάση61.Για τα αS και Tau441, ΔNt-Tau ή pLK, το μεγαλύτερο μέρος της πρωτεΐνης συγκεντρώθηκε στο συμπύκνωμα υπό τις συνθήκες που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη.Ωστόσο, ενώ τα σταγονίδια tau πλήρους μεγέθους συγχωνεύτηκαν γρήγορα κατά την επιφανειακή διαβροχή, η συνένωση και η διαβροχή των σταγονιδίων ήταν δύσκολη για τα ΔNt-Tau και pLK, υποδηλώνοντας ταχεία απώλεια ιδιοτήτων υγρού σε αυτά τα δύο συστήματα.Σύμφωνα με την ανάλυσή μας FLIM-FRET, τα ηλικιωμένα σταγονίδια pLK και ΔNt-Tau έδειξαν παρόμοιο βαθμό συσσωμάτωσης πρωτεΐνης (παρόμοιος χρόνος ζωής φθορισμού) με τα αρχικά σταγονίδια, υποδηλώνοντας ότι το αρχικό δίκτυο πρωτεΐνης διατηρήθηκε, αν και πιο άκαμπτο.
Εξορθολογίζουμε τα πειραματικά μας αποτελέσματα στο παρακάτω μοντέλο (Εικόνα 8).Τα αρχικά προσωρινά σχηματισμένα σταγονίδια είναι συχνά πρωτεϊνικά δίκτυα χωρίς ηλεκτροστατική αντιστάθμιση, και έτσι υπάρχουν περιοχές ανισορροπίας φορτίου, ειδικά στη διεπιφάνεια σταγονιδίων, με αποτέλεσμα σταγονίδια με υψηλό ηλεκτροστατικό επιφανειακό δυναμικό.Για να αντισταθμιστεί το φορτίο (ένα φαινόμενο που συνήθως αναφέρεται ως εξάντληση σθένους) και να ελαχιστοποιηθεί το επιφανειακό δυναμικό των σταγονιδίων, τα σταγονίδια μπορούν να περιλαμβάνουν νέα πολυπεπτίδια από την αραιή φάση, να αναδιοργανώσουν τα πρωτεϊνικά δίκτυα για να βελτιστοποιήσουν τις αλληλεπιδράσεις φορτίου-φόρτισης και να αλληλεπιδράσουν με άλλα σταγονίδια.με επιφάνειες (βρέξιμο).Τα σταγονίδια αS/pLK, λόγω του απλούστερου δικτύου πρωτεϊνών τους (μόνο ετεροτυπικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ αS και pLK) και της μεγαλύτερης συγγένειας για αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης, φαίνεται ότι μπορούν να εξισορροπήσουν το φορτίο του συμπυκνώματος πιο γρήγορα.Πράγματι, παρατηρήσαμε ταχύτερη κινητική πρωτεϊνών στα αρχικά σχηματισμένα αS/pLK coacervates από ό,τι στο αS/Tau.Μετά την εξάντληση του σθένους, οι αλληλεπιδράσεις γίνονται λιγότερο εφήμερες και τα σταγονίδια χάνουν τις υγρές τους ιδιότητες και μετατρέπονται σε πηκτοειδή, μη εύφλεκτα σταγονίδια με χαμηλό ηλεκτροστατικό δυναμικό επιφάνειας (και επομένως δεν μπορούν να βρέξουν την επιφάνεια).Αντίθετα, τα σταγονίδια αS/Tau είναι λιγότερο αποτελεσματικά στη βελτιστοποίηση της ισορροπίας φορτίου σταγονιδίων λόγω των πιο πολύπλοκων πρωτεϊνικών δικτύων (με ομοτυπικές και ετεροτυπικές αλληλεπιδράσεις) και της ασθενέστερης φύσης των αλληλεπιδράσεων πρωτεϊνών.Αυτό έχει ως αποτέλεσμα σταγονίδια που διατηρούν τη συμπεριφορά του υγρού για παρατεταμένες χρονικές περιόδους και παρουσιάζουν υψηλό ηλεκτροστατικό δυναμικό επιφάνειας που τείνει να ελαχιστοποιείται με τη συνένωση και την ανάπτυξη (ελαχιστοποιώντας έτσι την αναλογία επιφάνειας/όγκου των σταγονιδίων) και διαβρέχοντας το υδρόφιλο επιφανειακό χημικό.Αυτό δημιουργεί μεγάλες βιβλιοθήκες συμπυκνωμένων πρωτεϊνών που διατηρούν τις ιδιότητες υγρών καθώς οι αλληλεπιδράσεις παραμένουν πολύ παροδικές λόγω της συνεχούς αναζήτησης για βελτιστοποίηση φορτίου στο πρωτεϊνικό δίκτυο.Είναι ενδιαφέρον ότι οι αμινοτελικά κολοβωμένες μορφές του Tau, συμπεριλαμβανομένων κάποιων φυσικών ισομορφών62, παρουσιάζουν ενδιάμεση συμπεριφορά, με ορισμένα συσσωρευμένα να γερνούν με αS σε σταγονίδια που μοιάζουν με γέλη μεγάλης διάρκειας, ενώ άλλα μετατρέπονται σε μεγάλα υγρά συμπυκνώματα.Αυτή η δυαδικότητα στην ωρίμανση των ηλεκτροστατικών συσσωρευτών αS είναι συνεπής με πρόσφατες θεωρητικές και πειραματικές μελέτες LLPS που έχουν εντοπίσει μια συσχέτιση μεταξύ της εξάντλησης σθένους και του ηλεκτροστατικού κοσκινίσματος στα συμπυκνώματα ως κλειδί για τον έλεγχο του μεγέθους του συμπυκνώματος και των ιδιοτήτων του υγρού.Μηχανισμός 58,61.
Αυτό το σχήμα δείχνει την πιθανή οδό συσσωμάτωσης αμυλοειδούς για αS και Tau441 μέσω LLPS και LSPT.Με πρόσθετες περιοχές πλούσιες σε ανιόντα (κόκκινο) και πλούσιες σε κατιόντα (μπλε), τα ηλεκτροστατικά συσσωρευμένα αS και tau με ικανοποιητικό σθένος έχουν χαμηλότερη επιφανειακή ενέργεια και επομένως λιγότερη συνένωση, με αποτέλεσμα την ταχεία γήρανση των σταγονιδίων.Επιτυγχάνεται μια σταθερή κατάσταση μη συσσωματωμένης γέλης..Αυτή η κατάσταση είναι πολύ ευνοϊκή στην περίπτωση του συστήματος αS/pLK λόγω της υψηλότερης συγγένειας και του απλούστερου δικτύου αλληλεπίδρασης ζεύγους πρωτεϊνών, που επιτρέπει μια γρήγορη μετάβαση που μοιάζει με γέλη.Αντίθετα, σταγονίδια με μη ικανοποιητικό σθένος και, ως εκ τούτου, περιοχές φορτισμένες με πρωτεΐνη που είναι διαθέσιμες για αλληλεπίδραση, διευκολύνουν τη σύντηξη και διαβροχή της υδρόφιλης επιφάνειας του συσσωρευτή προκειμένου να μειωθεί η υψηλή επιφανειακή του ενέργεια.Αυτή η κατάσταση είναι προτιμότερη για αS/Tau441 coacervates, τα οποία έχουν ένα πολυσθενές σύνθετο δίκτυο που αποτελείται από ασθενείς αλληλεπιδράσεις Tau-Tau και αS-Tau.Με τη σειρά τους, τα μεγαλύτερα coacervates θα διατηρήσουν πιο εύκολα τις ιδιότητες που μοιάζουν με υγρά, επιτρέποντας την εμφάνιση άλλων αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνης-πρωτεΐνης.Τελικά, σχηματίζονται ετερογενή συσσωματώματα αμυλοειδούς που περιέχουν αS και tau μέσα στο υγρό του συσσωρευτή, τα οποία μπορεί να σχετίζονται με αυτά που βρίσκονται στα έγκλειστα σώματα, τα οποία είναι χαρακτηριστικά των νευροεκφυλιστικών ασθενειών.
Οι μεγάλες δομές που μοιάζουν με υγρό που σχηματίζονται κατά την ωρίμανση του αS/Tau441 με ένα εξαιρετικά συμφορημένο αλλά δυναμικό πρωτεϊνικό περιβάλλον και, σε μικρότερο βαθμό, οι συνενώσεις αS/ΔNt-Tau είναι ιδανικές δεξαμενές για τη δημιουργία πυρήνων της πρωτεϊνικής συσσώρευσης.Έχουμε πράγματι παρατηρήσει το σχηματισμό στερεών πρωτεϊνικών συσσωματωμάτων σε αυτόν τον τύπο συσσωρευτών πρωτεΐνης, που συχνά περιέχουν αS και tau.Δείξαμε ότι αυτά τα ετεροσυσσωματώματα σταθεροποιούνται από μη ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις, είναι σε θέση να δεσμεύουν ειδικές για αμυλοειδές βαφές ThT με τον ίδιο τρόπο όπως τα τυπικά αμυλοειδή ινίδια και πράγματι έχουν παρόμοια αντίσταση σε διάφορες επιδράσεις.Τα συσσωματώματα αS/tau που σχηματίζονται από το LLPS αποδείχθηκε ότι έχουν ιδιότητες παρόμοιες με αμυλοειδές.Πράγματι, η ώριμη παραλλαγή του Tau με ανεπάρκεια σε συσσωμάτωση αμυλοειδούς είναι σημαντικά μειωμένη στο σχηματισμό αυτών των ετερογενών συσσωματωμάτων αS εντός του υγρού ηλεκτροστατικού συσσωρευτή.Ο σχηματισμός συσσωματωμάτων αS/Tau441 παρατηρήθηκε μόνο στο εσωτερικό των συσσωρευτών, τα οποία διατηρούσαν ιδιότητες όμοιες με υγρό, και ποτέ, εάν τα συσσωμάτωμα/σταγονίδια δεν έφταναν στην κατάσταση γέλης.Στην τελευταία περίπτωση, η αυξημένη ισχύς των ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων και, ως αποτέλεσμα, η ακαμψία του πρωτεϊνικού δικτύου εμποδίζουν τις απαραίτητες διαμορφωτικές αναδιατάξεις των πρωτεϊνών για τη δημιουργία νέων πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων που είναι απαραίτητες για τον πυρήνα αμυλοειδούς.Ωστόσο, αυτό μπορεί να επιτευχθεί σε πιο εύκαμπτα, υγρά ομοιογενή, τα οποία με τη σειρά τους είναι πιο πιθανό να παραμείνουν υγρά καθώς αυξάνονται σε μέγεθος.
Το γεγονός ότι ο σχηματισμός συσσωματωμάτων εντός της συμπυκνωμένης φάσης είναι προτιμότερος σε μεγάλα συμπυκνώματα αS/Tau παρά σε μικρά σταγονίδια που πήζουν γρήγορα, υπογραμμίζει τη σημασία της αναγνώρισης των παραγόντων που ελέγχουν τη συνένωση σταγονιδίων.Έτσι, όχι μόνο υπάρχει μια τάση για διαχωρισμό φάσεων, αλλά και το μέγεθος του συμπυκνώματος πρέπει να ελέγχεται για τη σωστή λειτουργία καθώς και την πρόληψη ασθενειών58,61.Τα αποτελέσματά μας υπογραμμίζουν επίσης τη σημασία της ισορροπίας μεταξύ LLPS και LSPT για το σύστημα αS/Tau.Ενώ ο σχηματισμός σταγονιδίων μπορεί να προστατεύει από τη συσσωμάτωση αμυλοειδούς μειώνοντας την ποσότητα των μονομερών πρωτεΐνης που είναι διαθέσιμα υπό συνθήκες κορεσμού, όπως έχει προταθεί σε άλλα συστήματα63,64, η σύντηξη σταγονιδίων σε υψηλά επίπεδα σταγονιδίων μπορεί να οδηγήσει σε εσωτερική συσσωμάτωση πρωτεΐνης μέσω αργών διαμορφωτικών αναδιατάξεων.πρωτεϊνικά δίκτυα..
Συνολικά, τα δεδομένα μας τονίζουν έντονα τη συνάφεια του συνεκτικού σθένους και των ικανοποιημένων/μη ικανοποιημένων αλληλεπιδράσεων σε δίκτυα πτώσης στο πλαίσιο του LSPT.Συγκεκριμένα, δείχνουμε ότι τα συμπυκνώματα αS/Tau441 πλήρους μήκους είναι ικανά να συντήκονται αποτελεσματικά και να σχηματίζουν πυρήνα για να σχηματίσουν ετεροσυσσωματώματα παρόμοια με αμυλοειδές που περιλαμβάνουν και τις δύο πρωτεΐνες και προτείνουν έναν μοριακό μηχανισμό με βάση τα πειραματικά μας αποτελέσματα.Η συνσυσσώρευση δύο πρωτεϊνών στο υγρό αS/Tau που αναφέρουμε εδώ μπορεί πράγματι να σχετίζεται με τον συνεντοπισμό δύο πρωτεϊνών σε εγκλείσματα, τα οποία είναι χαρακτηριστικά γνωρίσματα της νόσου και μπορεί να συμβάλει στην κατανόηση της σχέσης μεταξύ LLPS και συσσωμάτωση αμυλοειδούς, ανοίγοντας το δρόμο για πολύ φορτισμένο IDP στον νευροεκφυλισμό.
Τα μονομερή WT-αS, οι μεταλλάξεις κυστεΐνης (Q24C-αS, N122C-αS) και οι παραλλαγές ΔCt-αS (Δ101-140) εκφράστηκαν σε E. coli και καθαρίστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως.5 mM DTT συμπεριλήφθηκε σε όλα τα στάδια στον καθαρισμό των μεταλλαγμάτων αS κυστεΐνης για την πρόληψη του σχηματισμού δισουλφιδικού δεσμού.Ισόμορφο Tau441 (πλασμίδιο που λαμβάνεται από το Addgene #16316), παραλλαγή ΔNt-Tau (Δ1–150, που λαμβάνεται με κλωνοποίηση IVA με εκκινητές CTTTAAGAAGGAGAGATACATATGATCGCCCACACCGCGG, CATATGTATATCCTCTCTTCTTAAAGTAAACTAF,57TCau3Tau37Tau31 εκκινητής) Ε. coli καλλιέργειες ήταν αναπτύχθηκε σε OD600 = 0,6-0,7 στους 37°C και 180 rpm, και η έκφραση προκλήθηκε με IPTG για 3 ώρες στους 37°C.Συλλέξτε κύτταρα στα 11.500 xg για 15 λεπτά στους 4 °C και πλύνετέ τα με ρυθμιστικό διάλυμα φυσιολογικού ορού που περιέχει 150 mM NaCl.Εναιωρήστε ξανά το ίζημα σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (20 ml ανά 1 L LB: MES 20 mM, pH 6,8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0,2 ​​mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, βενζαμιδίνη 50 μptin μM, cope).Το στάδιο της υπερήχων πραγματοποιήθηκε σε πάγο με πλάτος 80% για 10 παλμούς (1 λεπτό ενεργοποίηση, 1 λεπτό μακριά).Μην υπερβαίνετε τα 60 ml σε έναν υπέρηχο.Τα προϊόντα λύσης Ε. coli θερμάνθηκαν στους 95°C για 20 λεπτά, στη συνέχεια ψύχθηκαν σε πάγο και φυγοκεντρήθηκαν στα 127.000xg για 40 λεπτά.Το διαυγασμένο υπερκείμενο εφαρμόστηκε σε μεμβράνη 3,5 kDa (Spectrum™ Thermo Fisher Scientific, UK) και υποβλήθηκε σε διαπίδυση έναντι 4 L ρυθμιστικού διαλύματος αιμοκάθαρσης (20 mM MES, pH 6,8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT , PMSF 0,1 mM) για 10 ώρες.Μια στήλη ανταλλαγής κατιόντων 5 ml (HiTrap SPFF, Cytiva, ΜΑ, ΗΠΑ) εξισορροπήθηκε με ρυθμιστικό διάλυμα εξισορρόπησης (20 mM MES, ρΗ 6,8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0,1 mM PMSF).Το προϊόν λύσης ταυ διηθήθηκε μέσω φίλτρου PVDF 0,22 μm και εγχύθηκε στη στήλη με ρυθμό ροής 1 ml/min.Η έκλουση διεξήχθη σταδιακά, το tau εκλούστηκε με ρυθμιστικό διάλυμα έκλουσης 15-30% (20 mM MES, ρΗ 6,8, 1 Μ NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0,1 mM PMSF).Τα κλάσματα αναλύθηκαν με SDS-PAGE και τυχόν κλάσματα που περιείχαν μία ζώνη με το αναμενόμενο μοριακό βάρος ταυ συμπυκνώθηκαν χρησιμοποιώντας ένα φυγόκεντρο φίλτρο 10 kDa και αντικαταστάθηκαν με ένα ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει 10 mM HEPES, ρΗ 7,4, NaCl 500 mM και DTT 2 mM για η τελική συγκέντρωση πρωτεΐνης ήταν 100 μΜ.Το διάλυμα πρωτεΐνης στη συνέχεια πέρασε μέσω φίλτρου PVDF 0,22 μm, καταψύχθηκε γρήγορα και αποθηκεύτηκε στους -80°C.Η πρωτεΐνη Κ18 παρασχέθηκε ευγενικά από τον καθηγητή Alberto Boffi.Η καθαρότητα του παρασκευάσματος ήταν >95% όπως επιβεβαιώθηκε από SDS-PAGE και MALDI-TOF/TOF.Διάφορες κυστεΐνες επισημάνθηκαν χημικά με AlexaFluor488-μαλεϊμίδιο (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, ΜΑ, ΗΠΑ) ή TEMPOL-μαλεϊμίδιο (Toronto Research Chemicals, Τορόντο, Καναδάς).επιβεβαιώθηκαν με απορρόφηση και MALDI-TOF/TOF.Τα Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau και K18 επισημάνθηκαν με υπολείμματα φυσικής κυστεΐνης στις θέσεις 191 και 322 χρησιμοποιώντας Atto647N-μαλεϊμίδιο (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Γερμανία) ακολουθώντας την ίδια διαδικασία.Οι χάρτες καθαρής χρέωσης ανά υπόλειμμα για αS και Tau441 δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας το CIDER66.
Στερεά πολυ-L-λυσίνη (pLK DP 90-110 σύμφωνα με NMR από τον προμηθευτή, Alamanda Polymers Inc, Huntsville, Alabama, USA) διαλύθηκε σε 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7,4 έως 10 mM συγκέντρωση, διαδικασία υπερήχων για 5 λεπτά σε υδατόλουτρο υπερήχων και αποθηκεύστε στους -20°C.Τα PEG-8, δεξτράνη-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, ΗΠΑ) και FITC-δεξτράνη-500 (Sigma-Aldrich, Sant Louis, MI, USA) είναι υδατοδιαλυτά και διανέμονται ευρέως σε ρυθμιστικό διάλυμα LLPS.Η αιμοκάθαρση αφαιρεί τα μολυσματικά άλατα.Στη συνέχεια διηθήθηκαν μέσω φίλτρου σύριγγας με μέγεθος πόρων 0,22 μm και οι συγκεντρώσεις τους υπολογίστηκαν με τη χρήση διαθλασίμετρου (Mettler Toledo, Columbus, Ohio, ΗΠΑ).Δείγματα LLPS παρασκευάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου με την ακόλουθη σειρά: ρυθμιστικό και εξώθηση αναμίχθηκαν και 1 mM τρις(2-καρβοξυαιθυλ)φωσφίνη (TCEP, Carbosynth, Compton, UK), 1 mM 2,2,2,2-(Αιθάνιο- 1, 2-διυλδινιτρίλιο) τετραοξικό οξύ (EDTA, καρβοξυνθική) και ένα μείγμα 1% αναστολέα πρωτεάσης (PMSF 100 mM, βενζιμίδιο 1 mM, λευπεπτίνη 5 μΜ).Στη συνέχεια προστίθενται αS και συντηγμένα πολυκατιόντα (επιλογές pLK ή Tau).Για πειράματα χρονικής σειράς θειοφλαβίνης-Τ (ThT, Carbosynth, Compton, UK), χρησιμοποιήστε τη συνολική συγκέντρωση ThT ώστε να είναι η μισή της συγκέντρωσης αS.Ανακατέψτε απαλά αλλά επιμελώς τα δείγματα για να διασφαλίσετε ότι είναι ομοιογενή.Η συγκέντρωση κάθε συστατικού διέφερε από πείραμα σε πείραμα, όπως περιγράφεται στην ενότητα Αποτελέσματα.Το αζίδιο χρησιμοποιήθηκε σε συγκέντρωση 0,02% (β/ο) όποτε η διάρκεια του πειράματος υπερέβαινε τις 4 ώρες.Για όλες τις αναλύσεις που χρησιμοποιούν δείγματα LLPS, αφήστε το μείγμα να εξισορροπηθεί για 5 λεπτά πριν από την ανάλυση.Για ανάλυση σκέδασης φωτός, 150 μl δειγμάτων φορτώθηκαν σε μη δεσμευτικές μικροπλάκες 96 φρεατίων (μClear®, μαύρο, F-Bottom/Chimney Well, Greiner bio-one, Kremsmünster, Αυστρία) και καλύφθηκαν με αυτοκόλλητο φιλμ.Τα LLP παρακολουθήθηκαν με μέτρηση της απορρόφησης στα 350 nm στο κέντρο του διαλύματος σε συσκευή ανάγνωσης πλακών CLARIOstar (BMG Labtech, Ortenberg, Γερμανία).Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν στους 25°C και τα σφάλματα υπολογίστηκαν ως η τυπική απόκλιση από τον μέσο όρο.Η αραιή φάση προσδιορίστηκε ποσοτικά με φυγοκέντρηση δείγματος και ανάλυση γέλης SDS-PAGE, και το κλάσμα αS στην αραιή και συμπυκνωμένη φάση προσδιορίστηκε ποσοτικά σε διάφορα διαλύματα LLPS.Ένα δείγμα 100 μl LLPS που περιείχε 1 μΜ επισημασμένο με AF488 αS παρασκευάστηκε με σχολαστική ανάμειξη που ακολουθήθηκε από φυγοκέντρηση στα 9600 × g για 30 λεπτά, μετά την οποία το ίζημα ήταν συνήθως ορατό.Τα κορυφαία 50 μl του υπερκειμένου χρησιμοποιήθηκαν για ποσοτικοποίηση πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας γέλη SDS-PAGE.Τα πηκτώματα σαρώθηκαν με φίλτρα AF488 χρησιμοποιώντας σύστημα απεικόνισης γέλης ChemiDoc (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) ή χρωματίστηκαν με χρώση Coomassie και οπτικοποιήθηκαν με κατάλληλα φίλτρα.Οι ζώνες που προέκυψαν αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ImageJ έκδοση 1.53i (Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας, ΗΠΑ).Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις διπλούν σε δύο διαφορετικά πειράματα με παρόμοια αποτελέσματα.
Τυπικά, 150 μl δειγμάτων εφαρμόστηκαν σε μη δεσμευτικές μικροπλάκες 96 φρεατίων και οπτικοποιήθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου σε ανεστραμμένο μικροσκόπιο Leica DMI6000B (Leica Microsystems, Wetzlar, Γερμανία).Για πειράματα κηλίδας, χρησιμοποιήθηκαν επίσης πλάκες αγγειογένεσης μ-Slide (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Γερμανία) ή μικροπλάκες πολυστυρενίου 96 φρεατίων (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts).Ως πηγές φωτισμού χρησιμοποιήθηκαν λάμπες αλογόνου ή αλογονιδίου μετάλλου υδραργύρου EL6000 (για απεικόνιση BF/DIC και WF, αντίστοιχα).Για τη μικροσκοπία WF, χρησιμοποιήθηκε αντικειμενικός στόχος αέρα μεγέθυνσης 40x (Leica Microsystems, Γερμανία) για να εστιάσει το φως στο δείγμα και να το συλλέξει.Για δείγματα με σήμανση AF488 και ThT, διέγερση και εκπομπή φίλτρου με τυπικά σετ φίλτρων GFP, φίλτρα ζώνης διέγερσης και εκπομπής, αντίστοιχα, φίλτρα διέλευσης ζώνης 460–500 nm και 512–542 nm, και διχρωικό κάτοπτρο 495 nm.Για δείγματα με ετικέτα Atto647N, χρησιμοποιήθηκε ένα τυπικό σύνολο φίλτρων Cy5 με φίλτρα ζώνης διέγερσης και εκπομπής 628–40 nm και 692–40 nm, αντίστοιχα, και ένα διχρωμικό κάτοπτρο 660 nm.Για μικροσκοπία BF και DIC, χρησιμοποιήστε τον ίδιο αντικειμενικό στόχο συλλογής ανακλώμενου φωτός.Το συλλεγμένο φως καταγράφηκε σε κάμερα CCD Leica DFC7000 (Leica Microsystems, Γερμανία).Ο χρόνος έκθεσης ήταν 50 ms για απεικόνιση μικροσκοπίας BF και DIC και 20-100 ms για απεικόνιση μικροσκοπίας WF.Για σύγκριση, ο χρόνος έκθεσης για όλα τα πειράματα με ThT ήταν 100 ms.Πραγματοποιήθηκαν πειράματα χρονικής καθυστέρησης για να οπτικοποιηθεί η συνένωση σταγονιδίων, με εικόνες να συλλέγονται κάθε 100 ms για αρκετά λεπτά.Το ImageJ (NIH, USA) χρησιμοποιήθηκε για ανάλυση εικόνας.Τα πειράματα έγιναν εις τριπλούν με παρόμοια αποτελέσματα.
Για πειράματα συνεντοπισμού, FRAP και 3D ανακατασκευή, αποκτήθηκαν εικόνες σε ένα ανεστραμμένο ομοεστιακό μικροσκόπιο Zeiss LSM 880 χρησιμοποιώντας μια μπλε έκδοση ZEN 2 (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Γερμανία).Δείγματα 50 μl εφαρμόστηκαν σε τρυβλία μ-Slide Angiogenesis Petri (Ibidi GmbH, Gröfelfing, Γερμανία), υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ένα υδρόφιλο πολυμερές (ibiTreat) και τοποθετήθηκαν σε αντικειμενικό φακό εμβάπτισης λαδιού 63× (Plan-Apochromat 63×/NA 1.4 Oil) στο DIC).Οι εικόνες ελήφθησαν χρησιμοποιώντας γραμμές λέιζερ αργού 458 nm, 488 nm και 633 nm με ανάλυση 0,26 μm/pixel και χρόνο έκθεσης 8 μs/pixel για παράθυρα ανίχνευσης διέγερσης και εκπομπής 470–600 nm, 493–628 και 638–755 nm χρησιμοποιήθηκαν για την απεικόνιση των ThT, AF488 και Atto647N, αντίστοιχα.Για τα πειράματα FRAP, η φωτογραφία time-lapse κάθε δείγματος καταγράφηκε με 1 καρέ ανά δευτερόλεπτο.Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν σε θερμοκρασία δωματίου με παρόμοια αποτελέσματα.Όλες οι εικόνες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό Zen 2 blue edition (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Γερμανία).Οι καμπύλες FRAP κανονικοποιήθηκαν, σχεδιάστηκαν και προσαρμόστηκαν σε δεδομένα έντασης/χρόνου που εξήχθησαν από εικόνες χρησιμοποιώντας Zen 2 χρησιμοποιώντας OriginPro 9.1.Οι καμπύλες ανάκτησης προσαρμόστηκαν σε ένα μονο-εκθετικό μοντέλο για να ληφθεί υπόψη η μοριακή διάχυση με έναν πρόσθετο εκθετικό όρο για να ληφθεί υπόψη το φαινόμενο λεύκανσης απόκτησης.Στη συνέχεια υπολογίσαμε το D χρησιμοποιώντας την ονομαστική ακτίνα λεύκανσης και τον προηγουμένως προσδιορισμένο χρόνο ημιζωής ανάκτησης όπως στην εξίσωση των Kang et al.5 35 φαίνεται.
Οι απλές παραλλαγές κυστεΐνης του αS συντέθηκαν με 4-υδροξυ-2,2,6,6-τετραμεθυλπιπεριδινο-Ν-οξυλ (TEMPOL) στις θέσεις 24 (TEMPOL-24-αS) και 122 (TEMPOL-122-αS), αντίστοιχα.Επισήμανση περιστροφής Για πειράματα EPR, η συγκέντρωση αS ορίστηκε στα 100 μΜ και η συγκέντρωση PEG ήταν 15% (w/v).Για διάφορες συνθήκες συσσωμάτωσης, η αναλογία αS:pLK ήταν 1:10, ενώ οι αναλογίες αS:ΔNt-Tau και αS:Tau441 διατηρήθηκαν στο 1:1.Για πειράματα τιτλοδότησης δέσμευσης απουσία συνωστισμού, το TEMPOL-122-αS διατηρήθηκε στα 50 μΜ και τα πολυκατιόντα τιτλοδοτήθηκαν σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις, προετοιμάζοντας κάθε συνθήκη ξεχωριστά.Οι μετρήσεις CW-EPR πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα φασματόμετρο ζώνης X Bruker ELEXSYS E580 εξοπλισμένο με συντονιστή Bruker ER4118 SPT-N1 που λειτουργεί σε συχνότητα μικροκυμάτων (SHF) ~9,7 GHz.Η θερμοκρασία ρυθμίστηκε στους 25°C και ελέγχεται από έναν κρυοστάτη υγρού αζώτου.Τα φάσματα ελήφθησαν υπό ακόρεστες συνθήκες σε ισχύ MW 4 mW, πλάτος διαμόρφωσης 0,1 mT και συχνότητα διαμόρφωσης 100 kHz.Οι φασματικές εντάσεις κανονικοποιήθηκαν για να αποφευχθούν διαφορές στις συγκεντρώσεις σπιν μεταξύ των δειγμάτων και πιθανή μείωση του σπιν λόγω υπολειμματικών συγκεντρώσεων αναγωγικών παραγόντων σε δείγματα που περιέχουν Tau441 ή ΔNt-Tau (που υπάρχουν στα αρχικά διαλύματα πρωτεΐνης).Οι δεδομένες τιμές του g λήφθηκαν ως αποτέλεσμα της φασματικής μοντελοποίησης EPR που πραγματοποιήθηκε με χρήση του λογισμικού Easyspin (v. 6.0.0-dev.34) που υλοποιήθηκε στο Matlab®67.Για τη μοντελοποίηση των δεδομένων χρησιμοποιήθηκαν ισοτροπικά μοντέλα ενός/δύο συστατικών.Μετά την κανονικοποίηση όλων των σημάτων, τα υπολείμματα υπολογίστηκαν αφαιρώντας κάθε προσομοίωση από το αντίστοιχο πειραματικό φάσμα.Για ανάλυση τιτλοδότησης δέσμευσης, η σχετική ένταση της τρίτης ζώνης στη δεύτερη ζώνη του κανονικοποιημένου φάσματος EPR (IIII/III) χρησιμοποιήθηκε για την παρακολούθηση της δέσμευσης πολυκατιόντων με αS.Για την εκτίμηση της σταθεράς διάστασης (Kd), η καμπύλη που προέκυψε προσαρμόστηκε σε ένα κατά προσέγγιση μοντέλο που υποθέτει n πανομοιότυπες και ανεξάρτητες θέσεις δέσμευσης.
Πειράματα φασματοσκοπίας NMR πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας φασματόμετρο NMR Bruker Neo 800 ΜΗζ (1Η) εξοπλισμένο με κρυοανιχνευτή και βαθμίδα Ζ.Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας 130-207 μΜ αS και αντίστοιχα αS/ΔNt-Tau και pLK ισοδύναμα σε 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10% DO, pH 7,4 και πραγματοποιήθηκαν στους 15°C.Για την παρακολούθηση του LPS με NMR, προστέθηκε 10% PEG στα προαναμεμειγμένα δείγματα.Το διάγραμμα διαταραχής χημικής μετατόπισης (Εικ. 1β) δείχνει τις μέσες χημικές μετατοπίσεις 1Η και 15Ν.Τα φάσματα αS 2D1H-15N HSQC εκχωρήθηκαν με βάση μια προηγούμενη εκχώρηση (καταχώρηση BMRB #25227) και επιβεβαιώθηκαν με καταγραφή και ανάλυση των 3D φασμάτων των HNCA, HNCO και CBCAcoNH.Οι χημικές μετατοπίσεις 13Cα και 13Cβ υπολογίστηκαν παρουσία ΔNt-Tau ή pLK για τη μέτρηση πιθανών αλλαγών στις τάσεις της δευτερογενούς δομής σε σύγκριση με τις χημικές μετατοπίσεις αS στην καθαρή τυχαία διαμόρφωση πηνίου 68 (Συμπληρωματικό Σχήμα 5γ).Οι ρυθμοί R1ρ μετρήθηκαν καταγράφοντας πειράματα hsqctretf3gpsi (που ελήφθησαν από τη βιβλιοθήκη Bruker) με καθυστερήσεις 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400 και 800 ms, και οι εκθετικές συναρτήσεις προσαρμόστηκαν στην κορύφωση σε διαφορετικές τιμές φορές για τον προσδιορισμό του R1ρ και της πειραματικής του αβεβαιότητας.
Πειράματα μικροσκοπίας φθορισμού με ανάλυση χρόνου δύο χρωμάτων πραγματοποιήθηκαν σε εμπορικό συνεστιακό μικροσκόπιο φθορισμού MT200 (PicoQuant, Βερολίνο, Γερμανία) με χρονικά συσχετισμένη μέτρηση μονού φωτονίων (TCSPC).Η κεφαλή της διόδου λέιζερ χρησιμοποιείται για παλμική παρεμβαλλόμενη διέγερση (PIE), η δέσμη διέρχεται από έναν κυματοδηγό απλής λειτουργίας και συντονίζεται σε ισχύ λέιζερ 10 έως 100 nW για γραμμές λέιζερ 481 nm και 637 nm που μετρώνται μετά από διχρωικό κάτοπτρο.Αυτό εξασφαλίζει έναν βέλτιστο ρυθμό μέτρησης φωτονίων, αποφεύγοντας τις επιπτώσεις της παραμόρφωσης φωτονίων, της φωτολεύκανσης και του κορεσμού.Καλυπτρίδες ή πλάκες αγγειογένεσης μ-slide (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Γερμανία) τοποθετήθηκαν απευθείας σε νερό εμβάπτισης πάνω από φακό Super Apochromat 60x NA 1.2 με διορθωτικό κολάρο (Olympus Life Sciences, Waltham, USA).Ένας διχρωμικός καθρέφτης 488/640 nm (Semrock, Lake Forest, IL, USA) χρησιμοποιήθηκε ως διαχωριστής κύριας δέσμης.Η μη εστιασμένη ακτινοβολία μπλοκάρεται από μια οπή με διάμετρο 50 microns, στη συνέχεια η εστιασμένη ακτινοβολία χωρίζεται σε 2 διαδρομές ανίχνευσης από έναν διαχωριστή δέσμης 50/50.Μπροστά από τον ανιχνευτή χρησιμοποιήθηκαν φίλτρα εκπομπής ζώνης (Semrock, Lake Forest, IL, USA) 520/35 για την πράσινη βαφή (AF488) και 690/70 για την κόκκινη βαφή (Atto647N).Ως ανιχνευτές χρησιμοποιήθηκαν διόδους χιονοστιβάδας ενός φωτονίου (SPAD) (Micro Photon Devices, Bolzano, Italy).Τόσο η συλλογή δεδομένων όσο και η ανάλυση πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το εμπορικά διαθέσιμο λογισμικό SymphoTime64 (PicoQuant GmbH, Βερολίνο, Γερμανία).
Πενήντα μικρολίτρα δειγμάτων LLPS εφαρμόστηκαν σε φρεάτια αγγειογένεσης μ-Slide (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Γερμανία).Οι εικόνες που προκύπτουν εστιάζονται στα 20 μm πάνω από τον πυθμένα του φρέατος για βέλτιστη αντικειμενική απόσταση εργασίας για αιωρούμενα σταγονίδια και σε ~1 μm για σχεδίες και κουκκίδες με αξονική ανάλυση τουλάχιστον 0,25 μm/pixel και χρόνο καθυστέρησης 400 μs/pixel.Επιλέξτε δεδομένα εφαρμόζοντας ένα όριο έντασης με βάση τη μέση ένταση σήματος φόντου (PBG, μέση τιμή + 2σ) για κάθε κανάλι, έτσι ώστε να επιλέγονται μόνο σταγονίδια υγρής πρωτεΐνης, σχεδίες ή κηλίδες, φιλτράροντας κάθε πιθανή προέλευση από τη διασκορπισμένη φάση.Για να αναλύσουμε τη διάρκεια ζωής κάθε είδους (τ) κάθε καναλιού (πράσινο, "g" για AF488 και κόκκινο, "r" για Atto647N), επιλέξαμε περιοχές ενδιαφέροντος (ROI) που περιέχουν σταγονίδια, σχεδίες ή κηλίδες (Συμπληρωματικό Σχήμα 1 ).8b) και τα εξήγαγε προσαρμόζοντας τη διάσπαση διάρκειας ζωής τους (τD, τR και τP για σταγονίδια, σχεδίες ή κηλίδες, αντίστοιχα, βλέπε Συμπληρωματικό Σχ. 8γ) σε κάθε κανάλι χρησιμοποιώντας ανάλυση προσαρμογής ουράς και μοντέλο αποσύνθεσης δύο συστατικών.Μέσος όρος τ από τ .Οι ROI που παρήγαγαν πολύ λίγα φωτόνια για μια πολυεκθετική προσαρμογή εξαιρέθηκαν από την ανάλυση.Η αποκοπή που χρησιμοποιήθηκε ήταν <104 φωτόνια για σχεδίες και τελείες και 103 για σταγόνες.Τα σταγονίδια έχουν χαμηλότερο όριο επειδή είναι δύσκολο να ληφθούν καμπύλες αποσύνθεσης με υψηλότερες τιμές έντασης, καθώς τα σταγονίδια στο πεδίο εικόνας είναι συνήθως μικρότερα και λιγότερα πολυάριθμα.Οι ROI με πλήθος φωτονίων πάνω από το όριο συσσώρευσης φωτονίων (ορίστηκε σε >500 μετρήσεις/pixel) επίσης απορρίφθηκαν για ανάλυση.Αντιστοιχίστε την καμπύλη αποσύνθεσης έντασης που λαμβάνεται από την περιοχή ενδιαφέροντος με ένταση στο 90% της μέγιστης (λίγο μετά τη μέγιστη ένταση της αποσύνθεσης) από την αρχή της διάρκειας ζωής για να εξασφαλίσετε ελάχιστη παρεμβολή IRF διατηρώντας την ίδια για την αποσύνθεση όλης της έντασης ρυθμίσεις Σχετικό χρονικό παράθυρο Αναλύθηκαν 25 έως 50 ROI για σχεδίες και κηλίδες και 15-25 ROI για σταγόνες, εικόνες που επιλέχθηκαν από περισσότερες από 4 επαναλήψεις που καταγράφηκαν από τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα.Οι δοκιμές t δύο ουρών έχουν χρησιμοποιηθεί για την αξιολόγηση των στατιστικών διαφορών μεταξύ ειδών ή μεταξύ συστημάτων συνενώσεων.Για μια ανάλυση pixel προς pixel της διάρκειας ζωής (τ), υπολογίστηκε η συνολική εξασθένηση της διάρκειας ζωής στο πεδίο για κάθε κανάλι και πραγματοποιήθηκε μια προσέγγιση ενός μοντέλου εκθετικής εξασθένησης 2/3 συστατικών.Στη συνέχεια, η εξασθένηση διάρκειας ζωής για κάθε pixel προσαρμόστηκε χρησιμοποιώντας προηγουμένως υπολογισμένες τιμές τ, με αποτέλεσμα μια ψευδόχρωμη εικόνα προσαρμογής FLIM.Το εύρος ζωής του tail-fit ήταν το ίδιο σε όλες τις εικόνες του ίδιου καναλιού και κάθε διάσπαση παρήγαγε αρκετά φωτόνια για να παρέχει μια αξιόπιστη εφαρμογή.Για την ανάλυση FRET, τα εικονοστοιχεία επιλέχθηκαν εφαρμόζοντας ένα κατώφλι χαμηλότερης έντασης 100 φωτονίων, το οποίο είχε κατά μέσο όρο ένα σήμα φόντου (FBG) 11 φωτονίων.Η ένταση φθορισμού κάθε καναλιού διορθώθηκε με πειραματικά καθορισμένους συντελεστές διόρθωσης: 69 φασματική αλληλεπίδραση α ήταν 0,004, άμεση διέγερση β ήταν 0,0305, απόδοση ανίχνευσης γ ήταν 0,517.Η απόδοση FRET σε επίπεδο pixel υπολογίζεται στη συνέχεια χρησιμοποιώντας την ακόλουθη εξίσωση:
όπου FDD είναι η ένταση φθορισμού που παρατηρείται στο κανάλι δότη (πράσινο), FDA είναι η ένταση φθορισμού που παρατηρείται στο κανάλι δέκτη (κόκκινο) υπό έμμεση διέγερση και FAA είναι η ένταση φθορισμού που παρατηρείται στο κανάλι δέκτη (κόκκινο) υπό άμεση διέγερση ( ΠΙΤΑ).Στο κανάλι παρατηρούνται παλμοί έντασης φθορισμού).
Τοποθετήστε 100 μl διαλυμάτων αντίδρασης LLPS που περιέχουν 25 μΜ μη επισημασμένο μονομερές Tau441 (με ή χωρίς 25 μΜ αS) σε ρυθμιστικό διάλυμα LLPS (συμπληρωμένο όπως παραπάνω) σε μη δεσμευτικές μικροπλάκες 96 φρεατίων με επίστρωση με αυτοκόλλητο φύλλο και ο σχηματισμός σταγονιδίων ελέγχθηκε με μικροσκόπιο WF εξισορρόπησης.μέσα σε 10 λεπτά.Μετά από 48 ώρες επώασης σε θερμοκρασία δωματίου, επιβεβαιώθηκε η παρουσία πρωτεϊνικών σχεδιών και κηλίδων.Στη συνέχεια αφαιρέστε προσεκτικά το υγρό πάνω από τις σχεδίες από τα φρεάτια, στη συνέχεια προσθέστε 50 L ρυθμιστικού διαλύματος διάστασης (10 mM HEPES, pH 7,4, 1 M NaCl, 1 mM DTT) και επωάστε για 10 λεπτά.Η υψηλή συγκέντρωση άλατος διασφαλίζει ότι το LLPS δεν θα επαναληφθεί λόγω του υπολειπόμενου PEG και πιθανά συγκροτήματα πρωτεΐνης που σχηματίζονται μόνο από ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις θα αποσυναρμολογηθούν.Ο πυθμένας του φρεατίου στη συνέχεια ξύστηκε προσεκτικά με ένα άκρο μικροσιφώνου και το προκύπτον διάλυμα μεταφέρθηκε σε ένα κενό φρεάτιο παρατήρησης.Μετά την επώαση των δειγμάτων με 50 μΜ ThT για 1 ώρα, η παρουσία μεμονωμένων κηλίδων ελέγχθηκε με μικροσκοπία WF.Παρασκευάστε ινίδια αS που έχουν υποστεί επεξεργασία με υπερήχους επωάζοντας 300 μl ενός διαλύματος αS 70 μΜ σε PBS με pH 7,4, αζίδιο του νατρίου 0,01% στους 37 °C και 200 ​​rpm σε τροχιακό αναδευτήρα για 7 ημέρες.Το διάλυμα στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε στα 9600 × g για 30 λεπτά, το ίζημα επαναιωρήθηκε σε PBS ρΗ 7,4 και υποβλήθηκε σε υπερήχους (1 λεπτό, κύκλος 50%, πλάτος 80% σε συσκευή υπερήχων Vibra-Cell VC130, Sonics, Newton, USA) δείγματα ινιδίων με σχετικά ομοιόμορφη κατανομή μεγέθους μικρών ινιδίων.
Η ανάλυση FCS/FCCS και η ανίχνευση σύμπτωσης δύο χρωμάτων (TCCD) πραγματοποιήθηκαν στο ίδιο συνεστιακό μικροσκόπιο φθορισμού MT200 (Pico-Quant, Βερολίνο, Γερμανία) που χρησιμοποιήθηκε για τα πειράματα μικροσκοπίας FLIM-FRET χρησιμοποιώντας τη λειτουργία PIE.Η ισχύς λέιζερ για αυτά τα πειράματα προστέθηκε σε 6,0 μW (481 nm) και 6,2 μW (637 nm).Ο συνδυασμός αυτών των δυνάμεων λέιζερ επιλέχθηκε για να παράγει παρόμοια φωτεινότητα για τα ζεύγη φθοροφόρων που χρησιμοποιούνται, επιτυγχάνοντας παράλληλα βέλτιστους ρυθμούς μέτρησης και αποφεύγοντας τη φωτολεύκανση και τον κορεσμό.Τόσο η συλλογή δεδομένων όσο και η ανάλυση πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το εμπορικά διαθέσιμο λογισμικό SymphoTime64 έκδοση 2.3 (PicoQuant, Βερολίνο, Γερμανία).
Δείγματα απομονωμένων συσσωματωμάτων αS/Tau που λαμβάνονται με χρήση LLPS αραιώνονται σε ρυθμιστικό απομόνωσης στην κατάλληλη μονομοριακή συγκέντρωση (συνήθως μια αραίωση 1:500, καθώς τα συσσωματώματα είναι ήδη σε χαμηλές συγκεντρώσεις όταν απομονώνονται από δείγματα συνενώσεων).Τα δείγματα εφαρμόστηκαν απευθείας σε καλυπτρίδες (Corning, ΗΠΑ) προεπικαλυμμένες με διάλυμα BSA σε συγκέντρωση 1 mg/mL.
Για την ανάλυση PIE-smFRET στα πράσινα και κόκκινα κανάλια, εφαρμόστηκε ένα κατώφλι χαμηλότερης έντασης 25 φωτονίων για το φιλτράρισμα των σημάτων χαμηλής έντασης που προκαλούνται από μονομερή γεγονότα (σημειώστε ότι τα μονομερή υπερτερούν σε αριθμό των συγκεντρωτικών δειγμάτων σε σύγκριση με τα μεμονωμένα συσσωματώματα).Αυτό το κατώφλι υπολογίστηκε ως πενταπλάσια της μέσης έντασης του μονομερούς αS που λήφθηκε από την ανάλυση δειγμάτων καθαρού μονομερούς προκειμένου να επιλεγούν ειδικά συσσωματώματα για ανάλυση.Το κύκλωμα μετάδοσης κίνησης PIE, μαζί με την απόκτηση δεδομένων TSCPC, επέτρεψε την εφαρμογή ενός φίλτρου στάθμισης διάρκειας ζωής που βοηθά στην εξάλειψη του παρασκηνίου και της φασματικής αλληλεπίδρασης.Η ένταση έκλαμψης που επιλέχθηκε χρησιμοποιώντας τα παραπάνω κατώφλια διορθώθηκε χρησιμοποιώντας το μέσο σήμα υποβάθρου που προσδιορίστηκε από τα ιστογράμματα εμφάνισης σε σχέση με την ένταση/κάδο των δειγμάτων μόνο του buffer.Οι εκρήξεις που σχετίζονται με μεγάλα αδρανή συνήθως καταλαμβάνουν αρκετούς διαδοχικούς κάδους στο χρονικό ίχνος (ρυθμισμένο σε 1 ms).Σε αυτές τις περιπτώσεις, επιλέχθηκε ένας κάδος μέγιστης αντοχής.Για FRET και στοιχειομετρική ανάλυση χρησιμοποιήθηκε ο θεωρητικά προσδιορισμένος παράγοντας γάμμα γ (0,517).Οι συνεισφορές φασματικής αλληλεπίδρασης και άμεσης διέγερσης είναι αμελητέες (που προσδιορίζονται πειραματικά) στην ισχύ λέιζερ διέγερσης που χρησιμοποιείται.Η απόδοση και η στοιχειομετρία του FRET σε μια έκρηξη υπολογίζεται ως εξής.