ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Duplex Welded Tube για χημικό συστατικό της Χημικής Βιομηχανίας, η ανεπάρκεια SPECC1L οδηγεί σε αυξημένη σταθερότητα των ματισμένων αρθρώσεων και μειωμένη αποβολή των κυττάρων της κρανιακής νευρικής ακρολοφίας.

Σας ευχαριστούμε που επισκεφτήκατε το Nature.com.Χρησιμοποιείτε μια έκδοση προγράμματος περιήγησης με περιορισμένη υποστήριξη CSS.Για την καλύτερη εμπειρία, συνιστούμε να χρησιμοποιήσετε ένα ενημερωμένο πρόγραμμα περιήγησης (ή να απενεργοποιήσετε τη λειτουργία συμβατότητας στον Internet Explorer).Επιπλέον, για να διασφαλίσουμε τη συνεχή υποστήριξη, εμφανίζουμε τον ιστότοπο χωρίς στυλ και JavaScript.

ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Duplex Συγκολλημένος Σωλήνας για Χημική Βιομηχανία

Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.είναι κορυφαίος κατασκευαστής που ειδικεύεται σε σωλήνες χωρίς ραφή από ανοξείδωτο χάλυβα, φωτεινούς ανόπτησης σωλήνες, σωλήνες χωρίς ραφή κ.λπ.Για να διευκολύνουμε τους πελάτες, έχουμε συγκολλήσει σωλήνες και σωλήνες επίσης.Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.διαθέτει τον πιο προηγμένο εξοπλισμό παραγωγής και δοκιμής.Μπορούμε να ικανοποιήσουμε πλήρως την απαίτησή σας.Σύμφωνα με το πρότυπο πολύ αυστηρά, οι σωλήνες που παράγονται από εμάς έχουν πάντα σωστή ανοχή OD και WT.Ο έλεγχος ανοχής είναι αυστηρά σύμφωνος με τα πρότυπα παραγωγής.Τα προϊόντα μας είναι πάντα ικανοποιημένα με τους πελάτες.Οι πελάτες που αγόρασαν τα προϊόντα μας δημιούργησαν περισσότερα κέρδη.
α) OD (εξωτερική διάμετρος): 3,18 mm έως 101,6 mm
β) WT (Πάχος τοιχώματος): 0,5 mm έως 20 mm
γ) Μήκος: Σύμφωνα με την απαίτηση του πελάτη
δ) Πρότυπα: ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 κ.λπ
ε) Μέθοδος διαδικασίας: ERW, EFW κ.λπ

Ρυθμιστικά που εμφανίζουν τρία άρθρα ανά διαφάνεια.Χρησιμοποιήστε τα κουμπιά πίσω και επόμενο για να μετακινηθείτε στις διαφάνειες ή τα κουμπιά του ελεγκτή ολίσθησης στο τέλος για να μετακινηθείτε σε κάθε διαφάνεια.
Τα κύτταρα της κρανιακής νευρικής ακρολοφίας (CNCC) απομακρύνονται από τις εμβρυϊκές νευρικές πτυχές και μεταναστεύουν στα φαρυγγικά τόξα, τα οποία σχηματίζουν τις περισσότερες από τις δομές του μέσου προσώπου.Η δυσλειτουργία του CNCC παίζει σημαντικό ρόλο στην αιτιολογία της στοματοπροσωπικής σχισμής, μιας κοινής συγγενούς δυσπλασίας.Ετεροζυγωτικές μεταλλάξεις SPECC1L έχουν βρεθεί σε ασθενείς με άτυπες και συνδρομικές σχιστίες.Εδώ, αναφέρουμε ενισχυμένη χρώση των συστατικών της κανονικής συγκολλητικής σύνδεσης (AJ), της β-κατενίνης και της Ε-καντερίνης σε καλλιεργημένα κύτταρα knockdown SPECC1L και οι ηλεκτρονικές μικρογραφίες δείχνουν κορυφαία-βασική διάχυση του AJ.Για να κατανοήσουμε τον ρόλο του SPECC1L στην κρανιοπροσωπική μορφογένεση, δημιουργήσαμε ένα μοντέλο ποντικιού με έλλειψη Specc1l.Τα ομόζυγα μεταλλαγμένα είναι εμβρυϊκά θανατηφόρα και παρουσιάζουν εξασθενημένο κλείσιμο του νευρικού σωλήνα και ελασματοποίηση CNCC.Η χρώση της πρωτεΐνης AJ αυξάνεται σε μεταλλαγμένες νευρικές πτυχές.Αυτό το ελάττωμα AJ είναι συμβατό με ένα ελάττωμα στην αποκόλληση CNCC, που απαιτεί διάλυση του AJ.Επιπλέον, τα μεταλλάγματα Specc11 έχουν μειωμένη σηματοδότηση PI3K-AKT και αυξημένη απόπτωση.In vitro, ήπια αναστολή της σηματοδότησης PI3K-AKT σε κύτταρα άγριου τύπου ήταν αρκετή για να προκαλέσει αλλαγές AJ.Είναι σημαντικό ότι οι αλλαγές AJ που προκαλούνται από το knockdown SPECC1L μπορούν να αντιστραφούν με την ενεργοποίηση της οδού PI3K-AKT.Συνολικά, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι το SPECC1L, ως νέος ρυθμιστής της σηματοδότησης PI3K-AKT και της βιολογίας AJ, απαιτείται για το κλείσιμο του νευρικού σωλήνα και τη στρωματοποίηση CNCC.
Τα κύτταρα της κρανιακής νευρικής ακρολοφίας (CNCCs) εντοπίζονται στο ραχιαίο νευροεκτόδερμα και αποσπώνται από το νευροεπιθήλιο των αναπτυσσόμενων νευρικών πτυχών μέσω μιας διαδικασίας που περιλαμβάνει την επιθηλιακή-μεσεγχυματική μετάβαση (EMT)1,2,3.Τα προμεταναστευτικά επιθηλιακά CNCC διαταράσσουν τις μεσοκυτταρικές συνδέσεις και γίνονται μεταναστευτικά μεσεγχυματικά CNCC που γεμίζουν το πρώτο και το δεύτερο φαρυγγικό τόξο και σχηματίζουν το μεγαλύτερο μέρος του κρανιοπροσωπικού χόνδρου.Έτσι, τα γονίδια που ρυθμίζουν τη λειτουργία του CNCC συχνά διαταράσσονται στην αιτιολογία των συγγενών ανωμαλιών του κρανιοπροσωπικού, όπως οι στοματοπροσωπικές σχιστίες, που συνήθως επηρεάζουν το 1/800 γεννήσεις μόνο στις ΗΠΑ.Μία από τις συγγενείς παραμορφώσεις8.
Η αποκόλληση του CNCC συμπίπτει με το κλείσιμο του πρόσθιου νευρικού σωλήνα μεταξύ 8,5 και 9,5 ημερών εμβρυϊκής ανάπτυξης σε ποντίκια.Οι μεταλλάξεις ενός αριθμού γονιδίων που σχετίζονται με στοματοπροσωπική σχισμή ποντικού εμφανίζουν επίσης κάποια μορφή ελαττώματος του νευρικού σωλήνα, συμπεριλαμβανομένων των Irf69,10, Ghrl310, Cfl111 και Pdgfrα12.Ωστόσο, οι διαδικασίες κλεισίματος νευρικού σωλήνα και στρωματοποίησης CNCC μπορούν να θεωρηθούν ανεξάρτητες, καθώς ο μεταλλαγμένος ποντικός Splotch (Pax3) παρουσιάζει ελαττώματα στο κλείσιμο του νευρικού σωλήνα χωρίς καμία επίδραση στη στρωματοποίηση ή μετανάστευση CNCC 13,14.Πρόσθετα μοντέλα ποντικιών με ελαττώματα στην ανατομή CNCC και στο κλείσιμο του νευρικού σωλήνα θα βοηθήσουν στην οριοθέτηση της κοινής μοριακής βάσης αυτών των δύο διεργασιών.
Η απομόνωση του CNCC από νευροεπιθηλιακά κύτταρα απαιτεί τη διάλυση συγκολλητικών συνδέσμων (AJs), οι οποίες αποτελούνται από σύμπλοκα πρωτεϊνών που περιέχουν, μεταξύ άλλων, Ε-καντερίνη, β-κατενίνη, α-Ε-κατενίνη και α-ακτινίνη που σχετίζονται με νημάτια ακτίνης 2 Μελέτες υπερέκφρασης Η Ε-καντερίνη σε νευρικές πτυχές έδειξαν μείωση ή καθυστέρηση στην αποκόλληση του CNCC.Αντίθετα, η καταστολή της Ε-καντερίνης οδηγεί σε πρώιμη στρωματοποίηση15,16.Πολλοί από τους παράγοντες που μεσολαβούν στην EMT κατά τη στρωματοποίηση CNCC είναι παράγοντες μεταγραφής (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) και πρωτεΐνες αναδιαμόρφωσης εξωκυτταρικής μήτρας (ECM), όπως οι μεταλλοπρωτεϊνάσες μήτρας (MMPs), ωστόσο τα CNCC είναι άμεσοι κυτταροσκελετικοί ρυθμιστές δεν είναι ακόμη γνωστό.Η οδός PI3K-AKT είναι γνωστό ότι ανταγωνίζεται τα επίπεδα Ε-καντερίνης, κυρίως από την έρευνα για τον καρκίνο17.Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η απώλεια της σηματοδότησης PI3K-AKT που βασίζεται σε PDGFα σε ποντίκια οδηγεί σε κρανιοπροσωπικές ανωμαλίες, συμπεριλαμβανομένης της σχιστίας υπερώας και των ελαττωμάτων του νευρικού σωλήνα12.Ωστόσο, η σχέση μεταξύ της οδού PI3K-AKT και της σταθερότητας AJ κατά τη στρωματοποίηση CNCC είναι ασαφής.
Προηγουμένως εντοπίσαμε το SPECC1L ως το πρώτο μεταλλαγμένο γονίδιο σε δύο άτομα με σοβαρή σχισμή που εκτείνεται από το στόμα μέχρι το μάτι, γνωστή ως λοξή σχισμή (ObFC) ή σχισμή Tessier IV18.Μεταλλάξεις SPECC1L έχουν εντοπιστεί σε δύο οικογένειες πολλών γενεών με το αυτοσωμικό επικρατές σύνδρομο Opitz G/BBB (OMIM #145410), στο οποίο τα προσβεβλημένα άτομα εμφάνισαν υπεραπόσταση και σχιστία χείλους/ουρανίσκου19, και σε μία οικογένεια με σύνδρομο υπεραπόστασης της κνήμης (OM4201 #204) .περισσότερες από τις μισές περιπτώσεις συνδρόμου Opitz G/BBB συνδέονται με Χ (OMIM #300000) και προκαλούνται από μεταλλάξεις στο γονίδιο MID1, το οποίο κωδικοποιεί την πρωτεΐνη 22 του κυτταρικού σκελετού που σχετίζεται με τους μικροσωληνίσκους.Υποθέτουμε ότι η SPECC1L, επίσης μια πρωτεΐνη που σχετίζεται με μικροσωληνίσκους και τον κυτταροσκελετό της ακτίνης, μπορεί να μεσολαβεί στη σηματοδότηση που απαιτείται για την αναδιαμόρφωση του κυτταροσκελετού ακτίνης κατά τη διάρκεια της κυτταρικής προσκόλλησης και μετανάστευσης 18 .Μέσα από μελέτες in vitro και in vivo, περιγράφουμε τώρα το SPECC1L ως έναν νέο ρυθμιστή της σταθερότητας του AJ μέσω της σηματοδότησης PI3K-AKT.Σε κυτταρικό επίπεδο, η ανεπάρκεια SPECC1L είχε ως αποτέλεσμα μείωση του επιπέδου της πρωτεΐνης pan-AKT και αύξηση της κορυφαίας-βασικής διασποράς του AJ, η οποία εξαλείφθηκε με χημική ενεργοποίηση της οδού AKT.In vivo, τα έμβρυα με ανεπάρκεια Spec11 εμφανίζουν εξασθενημένο κλείσιμο του νευρικού σωλήνα και μειωμένη ανατομή του CNCC.Έτσι, το SPECC1L λειτουργεί σε εξαιρετικά ρυθμιζόμενη σηματοδότηση με βάση την κυτταρική προσκόλληση που απαιτείται για την κανονική λειτουργία του CNCC κατά τη μορφογένεση του προσώπου.
Για να χαρακτηρίσουμε τον ρόλο του SPECC1L σε κυτταρικό επίπεδο, χρησιμοποιήσαμε την προηγουμένως περιγραφείσα σταθερή κυτταρική σειρά οστεοσαρκώματος U2OS με έλλειψη SPECC1L18.Αυτά τα σταθερά κύτταρα U2OS με αναστολή SPECC1L (kd) είχαν μέτρια (60–70%) μείωση στα επίπεδα των μεταγραφών και πρωτεϊνών SPECC1L, μαζί με ελαττώματα στη μετανάστευση και την αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης 18. Αντίθετα, μια σοβαρή παροδική μείωση στο Το SPECC1L έχει αποδειχθεί ότι οδηγεί σε μιτωτικά ελαττώματα 23 .Μετά από περαιτέρω χαρακτηρισμό, βρήκαμε ότι τα σταθερά μας SPECC1L-kd κύτταρα άλλαξαν μορφολογία σε πολύ υψηλό βαθμό συρροής (Εικόνα 1).Τα μεμονωμένα κύτταρα ελέγχου και τα κύτταρα kd σε χαμηλή συρροή φαίνονταν παρόμοια (Εικόνα 1Α, Δ).24 ώρες μετά τη σύντηξη, τα κύτταρα ελέγχου διατήρησαν το κυβοειδές σχήμα τους (Εικ. 1Β, Ε), ενώ τα κύτταρα SPECC1L-kd επιμήκυναν (Εικ. 1C, F).Η έκταση αυτής της αλλαγής στο σχήμα των κυττάρων καταγράφηκε με in vivo ζωντανή απεικόνιση των κυττάρων ελέγχου και των κυττάρων kd (ταινία 1).Για να προσδιοριστεί ο ρόλος του SPECC1L σε συρρέοντα κύτταρα, εξετάσαμε πρώτα την έκφρασή του.Βρήκαμε ότι τα επίπεδα πρωτεΐνης SPECC1L αυξήθηκαν κατά τη σύντηξη (Εικόνα 1G), ενώ τα επίπεδα μεταγραφής SPECC1L δεν αυξήθηκαν (Εικόνα 1Η).Επιπλέον, καθώς αυξανόταν η κυτταρική πυκνότητα, η πρωτεΐνη SPECC1L συσσωρεύτηκε στα μεσοκυττάρια όρια (Σχ. 2Α-Ε), με ένα σχέδιο που επικαλύπτεται με αυτό της β-κατενίνης που σχετίζεται με τη μεμβράνη (Σχ. 2Α'-Ε').Δεδομένης της συσχέτισης του SPECC1L με τον κυτταροσκελετό ακτίνης 18,23 υποθέσαμε ότι το SPECC1L αλληλεπιδρά με συγκολλητικές συνδέσεις με βάση την ακτίνη (AJ).
(AF) SPECC1L knockdown (DF) κύτταρα επιμηκύνονται σε υψηλή συρροή (F) σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου U2OS (AC).Εδώ εμφανίζονται τρία από τα έξι χρονικά σημεία (T1, T3, T6) που επιλέξαμε για διαφορετικές πυκνότητες κελιών.(Ζ) Ανάλυση στυπώματος Western που δείχνει ότι η πρωτεΐνη SPECC1L σταθεροποιείται σε υψηλό βαθμό συρροής σε σύγκριση με χαμηλό βαθμό συρροής στα κύτταρα ελέγχου.Το στύπωμα Western του SPECC1L δείχνει την αναμενόμενη ζώνη των 120 kDa και μια ζώνη υψηλότερου μοριακού βάρους, πιθανώς μετα-μεταφραστικά τροποποιημένη (*).Η ανάλυση στυπώματος Western πραγματοποιήθηκε υπό τις ίδιες συνθήκες για χαμηλή και υψηλή συρροή.Εικόνες που δείχνουν SPECC1L σε χαμηλή και υψηλή συρροή ελήφθησαν από την ίδια κηλίδα.Το ίδιο στύπωμα αφαιρέθηκε και επανεξετάστηκε με αντίσωμα β-ακτίνης.(Η) Η ποσοτική ανάλυση RT-PCR δεν έδειξε σημαντικές αλλαγές στα επίπεδα μεταγραφής SPECC1L.Οι γραμμές σφαλμάτων αντιπροσωπεύουν SEM από τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα.
(AE) Επιλέξαμε έξι χρονικά σημεία (T1-T6) που αντιπροσωπεύουν ένα εύρος πυκνοτήτων κυττάρων για να ομαλοποιήσουμε την ανάλυση σχήματος κυττάρου και τις αλλαγές AJ σε κύτταρα U2OS με SPECC1L knockdown (kd).Τα πρώτα πέντε από αυτά τα χρονικά σημεία περιελάμβαναν μεμονωμένα κύτταρα (Τ1), 50-70% σύντηξη μικρών συστάδων κυττάρων (Τ2), σύντηξη χωρίς αναμόρφωση κυττάρων kd (Τ3), ανασχηματισμό κυττάρων kd (Τ4) και αλλαγές 24 ωρών.στην οπίσθια μορφή των κυττάρων kd (Τ5).Η πρωτεΐνη SPECC1L διασκορπίστηκε κυρίως στο κυτταρόπλασμα στο Τ1 (Α), αλλά η συσσώρευσή της παρατηρήθηκε στα μεσοκυττάρια όρια σε επόμενα χρονικά σημεία (Β-Ε, βέλη).Η (FJ) β-κατενίνη παρουσιάζει παρόμοια συσσώρευση στα μεσοκυττάρια όρια που σχετίζονται με το σύμπλεγμα AJ.(Α'-Ε') Το SPECC1L και η β-κατενίνη εμφανίζουν επικαλυπτόμενη χρώση στα όρια των κυττάρων σε υψηλή κυτταρική πυκνότητα (βέλη).(F'-J') Στα κύτταρα SPECC1L-kd, η χρώση με β-κατενίνη εμφανίζεται φυσιολογική σε χαμηλή κυτταρική πυκνότητα (F'-H'), αλλά επεκτείνεται καθώς αλλάζει το σχήμα των κυττάρων (I', J', βέλη), υποδεικνύοντας ότι το AJ έχει αλλάξει.Ράβδοι = 10 μm.
Στη συνέχεια προσπαθήσαμε να προσδιορίσουμε την επίδραση της ανεπάρκειας SPECC1L στον AJ.Χρησιμοποιήσαμε αρκετούς δείκτες που σχετίζονται με το AJ, συμπεριλαμβανομένων των κανονικών συστατικών F-actin, myosin IIb, β-catenin και E-cadherin24,25,26,27.Οι ίνες στρες ακτίνης αυξήθηκαν σε κύτταρα SPECC1L-kd όπως περιγράφηκε προηγουμένως (Εικ. 3Α, Β) 18 .Η μυοσίνη IIb που σχετίζεται με νημάτια ακτίνης έδειξε παρόμοια αύξηση στα κύτταρα SPECC1L-kd in vitro (Εικ. 3C,D).Η β-κατενίνη που σχετίζεται με το AJ συνδέεται με την καντερίνη στην κυτταρική μεμβράνη, δείχνοντας ένα φυσιολογικό μοτίβο έκφρασης «κηρήθρας» στα κυβοκύτταρα ελέγχου (Εικ. 3Ε, G).Είναι ενδιαφέρον ότι σε επίπεδες εικόνες που χρησιμοποιούν συνεστιακή μικροσκοπία, η β-κατενίνη (Εικ. 3Ε, ΣΤ) και η Ε-καντερίνη (Εικ. 3G, Η) χρώση στην κυτταρική μεμβράνη συρρέοντος κυττάρων με ανεπάρκεια SPECC1L έδειξε εμφανή μοτίβα εκτεταμένης χρώσης.Αυτή η επέκταση της σχετιζόμενης με AJ χρώσης β-κατενίνης σε κύτταρα kd ήταν πιο έντονη στη συρροή, αλλά φάνηκε να προηγείται των αλλαγών στο σχήμα των κυττάρων (Εικ. 2F-J, F'-J').Για να προσδιορίσουμε τη φυσική φύση αυτής της εκτεταμένης χρώσης AJ, εξετάσαμε τα όρια των κυττάρων στην κορυφαία-βασική επιφάνεια των κυττάρων SPECC1L-kd U2OS με ηλεκτρονική μικροσκοπία μετάδοσης (TEM) (Εικόνα 3I,J).Σε αντίθεση με τα κύτταρα ελέγχου (Εικ. 3I), τα οποία είχαν ξεχωριστές περιοχές πυκνότητας ηλεκτρονίων ενδεικτικές του AJ (βέλη), τα κύτταρα kd (Εικ. 3J) έδειξαν μεγάλες, συνεχόμενες περιοχές υψηλής πυκνότητας ηλεκτρονίων ενδεικτικές του AJ κατά μήκος του απικοβασικού επιπέδου..Επιπλέον, σε εγκάρσιες τομές, παρατηρήσαμε εκτεταμένες πτυχές κυτταρικής μεμβράνης σε κύτταρα kd (Εικ. S1A,B), γεγονός που εξηγεί το εκτεταμένο σχέδιο των ζωνών χρώσης β-κατενίνης και Ε-καντερίνης (Εικ. 3F,H).Προς υποστήριξη του ρόλου του SPECC1L στα AJs, η β-κατενίνη συν-ανοσοκαταβυθίστηκε με το SPECC1L σε προϊόντα λύσης συρρέοντων κυττάρων U2OS (Εικ. 3Κ).Μαζί με την εκτεταμένη ανοσοχρώση για δείκτες AJ, η ανάλυση TEM ήταν σύμφωνη με την υπόθεσή μας ότι η ανεπάρκεια SPECC1L αυξάνει την κορυφαία-βασική πυκνότητα και τη διακύμανση του AJ.
(ΑΗ) Αυξημένη χρώση F-ακτίνης σε κύτταρα kd 48 ώρες μετά τη σύντηξη (Τ6, Α, Β).Τροποποιημένη χρώση της μυοσίνης IIb που σχετίζεται με την F-ακτίνη (C, D).Το ομαλό σχέδιο της χρώσης μεμβράνης β-κατενίνης και Ε-καντερίνης σε κύτταρα ελέγχου (Ε, G) ενισχύθηκε σε κύτταρα SPECC1L-kd (F, Η).Ράβδοι = 10 μm.(I–J) Ηλεκτρονικές μικρογραφίες που παρατηρούν την κορυφαία-βασική μεσοκυττάρια ένωση.Τα κύτταρα ελέγχου εμφανίζουν διακριτές περιοχές πυκνότητας ηλεκτρονίων που υποδεικνύουν κολλώδεις συνδέσεις (I, βέλη).Αντίθετα, ολόκληρη η σύνδεση κορυφής-βασικής στα κύτταρα SPECC1L-kd εμφανίστηκε πυκνή ηλεκτρονίων (J, βέλη), υποδεικνύοντας αυξημένη πυκνότητα και διασπορά των συγκολλητικών συνδέσεων.Η (Κ) β-κατενίνη συν-ανοσοκαταβυθίστηκε με SPECC1L σε συρρέοντα κυτταρολύματα U2OS.Εικόνα τραβηγμένη από ένα σημείο που αντιπροσωπεύει ένα από τα τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα.
Για να κατανοήσουμε τον ρόλο του SPECC1L στην κρανιοπροσωπική μορφογένεση, δημιουργήσαμε ένα μοντέλο ποντικιού με έλλειψη Specc1l χρησιμοποιώντας δύο ανεξάρτητες κυτταρικές σειρές παγίδας ES, DTM096 και RRH048 (BayGenomics, CA), οι οποίες αντιπροσωπεύουν τα μεταγραφήματα ιντρονίου 1 και Specc1l που καταγράφηκαν στο 115 (Εικ. .4Α, σχήμα S2).Η γονιδιωματική θέση του ενθέτου φορέα δόλωμα προσδιορίστηκε με αλληλουχία ολόκληρου του γονιδιώματος και επιβεβαιώθηκε με PCR (Εικ. S2).Και τα δύο σχέδια γονιδιακής παγίδας επέτρεψαν επίσης τη σύντηξη εντός πλαισίου των ανταποκριτών Specc11-lacZ κατά τη σύλληψη.Ως εκ τούτου, η έκφραση lacZ που προσδιορίστηκε με χρώση X-gal χρησιμοποιήθηκε ως δείκτης έκφρασης Specc11.Και τα δύο αλληλόμορφα έδειξαν παρόμοια πρότυπα έκφρασης lacZ, με την παγίδα γονιδίου DTM096 στο εσώνιο 1 να δείχνει ισχυρότερη έκφραση από το RRH048 στο εσώνιο 15 (δεν φαίνεται).Ωστόσο, το Spec1l εκφράζεται ευρέως, με ιδιαίτερα έντονη έκφραση στις νευρικές πτυχές στο Ε8.5 (Εικόνα 4Β), στον νευρικό σωλήνα και τις διεργασίες του προσώπου στο Ε9.5 και Ε10.5 (Εικόνα 4C,D) και στα αναπτυσσόμενα άκρα στο Ε10.5 και μάτια (Εικόνα 4Δ).Αναφέραμε προηγουμένως ότι η έκφραση SPECC1L στο πρώτο φαρυγγικό τόξο στο E10.5 ήταν παρούσα στο επιθήλιο και το υποκείμενο μεσέγχυμα18, σύμφωνα με τη γενεαλογία CNCC.Για να ελέγξουμε την έκφραση SPECC1L στο CNCC, πραγματοποιήσαμε νευρικές πτυχές E8.5 (Εικόνα 4E-J) και τομές κρανίου Ε9.5 (Εικόνα 4K-).Στο E8.5, το SPECC1L βάφτηκε έντονα νευρικές πτυχές (Εικ. 4Ε, Η), συμπεριλαμβανομένων κυττάρων που χρωματίστηκαν με δείκτες NCC (Εικ. 4G, J).Στο E9.5, το SPECC1L (Εικ. 4K, N) με ισχυρή χρώση μεταναστευτικού CNCC συν-χρωματισμένο με AP2A (Εικ. 4L, M) ή SOX10 (Εικ. 4O, P).
(Α) Σχηματική αναπαράσταση του γονιδίου Specc11 ποντικού που δείχνει την εισαγωγή φορέα δολώματος σε κυτταρικούς κλώνους ES DTM096 (ιντρόνιο 1) και RRH048 (ιντρόνιο 15).(BD) lacZ χρώση ετερόζυγων εμβρύων Spec1lDTM096 που αντιπροσωπεύουν έκφραση Spec1l από Ε8.5 έως Ε10.5.NE = νευροεκτόδερμα, NF = νευρική πτυχή, PA1 = πρώτο φαρυγγικό τόξο.(EP) Ανοσοχρώση SPECC1L με δείκτες NCC AP2A και SOX10 σε νευρικές πτυχές E8.5 (NF; EJ) και τομές κρανίου E9.5 (KP).Η χρώση SPECC1L παρατηρήθηκε ευρέως στις νευρικές πτυχές Ε8.5 (Ε, Η, αιχμές βελών), συμπεριλαμβανομένων κυττάρων σημασμένων με AP2A (F, G, κεφαλές βελών) και SOX10 (I, J, αιχμές βελών).Στο E9.5, το SPECC1L βάφτηκε έντονα μεταναστευτικά CNCC (K, N, βέλη) με σήμανση AP2A (L, M, βέλη) και SOX10 (O, P, βέλη).
Η διασταύρωση μεταξύ ετερόζυγων ποντικών Spec1lDTM096/+ και Spec1lRRH048/+ δείχνει ότι τα δύο αλληλόμορφα γονιδιακής παγίδας δεν είναι συμπληρωματικά και ότι οι σύνθετοι ετεροζυγώτες και οι εμβρυϊκοί ομοζυγώτες για κάθε αλληλόμορφο παγίδα γονιδίου είναι θανατηφόρα εμβρυϊκά (Πίνακας S1).Οι αναλογίες Μενδέλης έδειξαν μείωση του ποσοστού επιβίωσης των ετεροζυγώτων κατά τη γέννηση (αναμενόμενο 1,34 έναντι 2,0).Παρατηρήσαμε χαμηλή περιγεννητική θνησιμότητα μεταξύ των ετεροζυγωτών, μερικοί είχαν κρανιοπροσωπικές ανωμαλίες (Εικ. S3).Ωστόσο, η χαμηλή διείσδυση αυτών των περιγεννητικών κρανιοπροσωπικών φαινοτύπων καθιστά δύσκολη τη μελέτη των υποκείμενων παθοφυσιολογικών μηχανισμών τους.Ως εκ τούτου, εστιάσαμε στον εμβρυϊκό θανατηφόρο φαινότυπο των ομόζυγων μεταλλαγμάτων Specc11.
Τα περισσότερα σύνθετα ετερόζυγα ή ομόζυγα μεταλλαγμένα έμβρυα Spec1lDTM096/RRH048 δεν αναπτύχθηκαν μετά το E9.5–10.5 (Εικ. 5A–D) και ο νευρικός σωλήνας δεν έκλεισε εμπρός (Εικ. 5B, D) και μερικές φορές έκλεισε οπίσθια (δεν φαίνεται) ..Αυτό το ελάττωμα κλεισίματος του κρανιακού νευρικού σωλήνα συσχετίστηκε με την πλειονότητα των DLX2 με σήμα CNCC να παραμένουν στις νευρικές πτυχές στο E10.5, υποδεικνύοντας ότι δεν υπάρχει ανατομή (Εικόνα 5A'-D').Για να προσδιορίσουμε εάν το συνολικό μέγεθος του CNCC μειώθηκε επίσης, επισημάναμε τις γραμμές CNCC με GFP στις γραμμές γονιδιακής παγίδας με Wnt1-Cre και ROSAmTmG.Πραγματοποιήσαμε ταξινόμηση GFP+ NCC και GFP- (RFP+) non-NCC από ολόκληρα έμβρυα.Στο E9.5, η αναλογία των CNCC με επισήμανση GFP με ταξινόμηση ροής δεν άλλαξε σημαντικά μεταξύ WT και μεταλλαγμένων εμβρύων (δεν φαίνεται), υποδεικνύοντας κανονικές προδιαγραφές CNCC.Επομένως, υποθέσαμε ότι η υπολειπόμενη χρώση Wnt1-Cre και DLX2 σε εκτεθειμένες νευρικές πτυχές (Εικόνα 5Β') οφειλόταν σε ελαττωματική στρωματοποίηση CNCC, πιθανώς λόγω αυξημένης πυκνότητας ή διασποράς των κυττάρων AJ, όπως φαίνεται στα κύτταρα SPECC1L-kd.Χρησιμοποιήσαμε τους δείκτες NCC SOX10, AP2A και DLX2 για να επιβεβαιώσουμε την παρουσία CNCC στη νευρική πτυχή (Εικόνα 5E-R).Στο E8.5, παρατηρήθηκε χρώση νευρικής πτυχής και για τους τρεις δείκτες NCC σε τομές του WT (Εικ. 5Ε, G, Ι) και του μεταλλάγματος Spec.11 (Εικ. 5F, Η, J).Στο E9.5, ενώ οι δείκτες NCC έβαφαν το μεταναστευτικό NCC σε τομές WT (Εικ. 5M, O, Q), παρατηρήθηκε υπολειπόμενη χρώση NCC σε εκτεθειμένες νευρικές πτυχές μεταλλαγμένων εμβρύων Specc11 (Εικ. 5N, P, R).Επειδή τα SOX10 και DLX2 σηματοδοτούν μεταναστευτικά CNCC, αυτό το αποτέλεσμα υποδηλώνει ότι τα CNCC με έλλειψη SPECC1L επιτυγχάνουν μετα-μεταναστευτικές προδιαγραφές αλλά αποτυγχάνουν να μεταναστεύσουν από νευρικές πτυχές.
Η ανεπάρκεια Specc11 οδηγεί σε ελαττωματικό κλείσιμο του νευρικού σωλήνα, αποκόλληση των κυττάρων της κρανιακής νευρικής ακρολοφίας και των AJ.
(Α, Β') Ε9.5 WT (Α) Έμβρυο που φέρει μεταναστευτικά κύτταρα κρανιακής νευρικής ακρολοφίας (CNCC) επισημασμένα με Wnt1-Cre (Α').Αντίθετα, τα μεταλλαγμένα έμβρυα Specc11 εμφανίζουν ανοιχτές νευρικές πτυχές (Β), αιχμές βελών) και CNCC που δεν έχουν μεταναστεύσει (Β', αιχμές βελών).(C, D') Εικόνες φωτεινού πεδίου (C, D') και ανοσοχρώση (C', D') του δείκτη CNCC DLX2 των εμβρύων E10.5 WT (C, C') και Spec1l (D, D').Στα έμβρυα WT E10.5, τα θετικά για DLX2 CNCC αποικίζουν τα βραγχιακά τόξα (C', βέλη), ενώ στα μεταλλαγμένα, η εμφανής χρώση επιμένει στις ανοιχτές νευρικές πτυχές (D', βέλη) και στα πρώτα φαρυγγικά τόξα (D', βέλη).) με κάποια χρώση (βέλη) που υποδεικνύουν κακή αποκόλληση και μετανάστευση του CNCC.ER) Τομές μεταλλαγμένων εμβρύων WT και Spec1l στα στάδια E8.5 (E-L) και E9.5 (M-R) επισημάνθηκαν με δείκτες NCC SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, Ο, Ρ) και DLX2 (I, J, Q, R).Στο E8.5, παρατηρήθηκε χρώση NCC σε νευρικές πτυχές άγριου τύπου (NF) και μεταλλαγμένες τομές.Η ταυτόχρονη χρώση του SOX10 και της β-κατενίνης στο E8.5 WT (K) και του μεταλλαγμένου (L) αποκάλυψε αυξημένη χρώση β-κατενίνης στα όρια των κυττάρων στις νευρικές πτυχές.Στο E9.5, παρατηρήθηκε χρώση άγριου τύπου μεταναστευτικών CNCC (M, O, Q), ενώ σε μεταλλαγμένα, μη στρωματοποιημένα CNCCs χρωματίστηκαν ανοιχτές νευρικές πτυχές (N, P, R).(S–Z) In vivo ανάλυση επισήμανσης AJ σε στεφανιαίες τομές εμβρύων WT και Spec11DTM096/RRH048 με τη μετάλλαξη Ε9.5.Ένα κατά προσέγγιση επίπεδο τομής εμφανίζεται στην επάνω δεξιά γωνία.Σε τομές μεταλλαγμένων ιστών, παρατηρήθηκε αυξημένη χρώση της F-ακτίνης (S, T) και της μυοσίνης IIb (U, V).Παρόμοια με τα αποτελέσματα in vitro στο Σχ. 3, σε μεταλλαγμένα έμβρυα, παρατηρήθηκε ενισχυμένη χρώση μεμβράνης για β-κατενίνη (W, X) και Ε-καντερίνη (Y, Z).(AA-BB) Μια ηλεκτρονική μικρογραφία μιας τομής ενός εμβρύου άγριου τύπου που κοιτάζει πέρα ​​από τα όρια του κορυφαίου-βασικού κυττάρου δείχνει μια ευδιάκριτη περιοχή πυκνότητας ηλεκτρονίων ενδεικτική των συγκολλητικών συνδέσεων (AA, βέλη).Αντίθετα, σε τμήματα μεταλλαγμένων εμβρύων Specc11 (ΒΒ, βέλη), ολόκληρη η ακροβασική ένωση είναι πυκνή σε ηλεκτρόνια, υποδηλώνοντας αυξημένη πυκνότητα και διασπορά των συγκολλητικών συνδέσεων.
Για να ελέγξουμε την υπόθεσή μας ότι η μειωμένη στρωματοποίηση οφείλεται σε αλλοιωμένο AJ, εξετάσαμε την επισήμανση AJ σε εκτεθειμένες νευρικές πτυχές μεταλλαγμένων εμβρύων Spec.1l (Εικ. 5S-Z).Παρατηρήσαμε μια αύξηση στις ίνες καταπόνησης ακτίνης (Εικ. 5S, T) και μια ταυτόχρονη αυξημένη εντόπιση της χρώσης της μυοσίνης IIB στις ίνες ακτίνης (Εικ. 5U, V).Είναι σημαντικό ότι παρατηρήσαμε αυξημένη χρώση της β-κατενίνης (Εικ. 5W,X) και της Ε-καντερίνης (Εικ. 5Y,Z) στα μεσοκυττάρια όρια.Εξετάσαμε επίσης τη χρώση με β-κατενίνη του NCC στις νευρικές πτυχές των εμβρύων Ε8.5 (Εικ. 5Κ, L).Η χρώση με β-κατενίνη φάνηκε να είναι ισχυρότερη στις μεταλλαγμένες νευρικές πτυχές Spec.Σε ηλεκτρονικές μικρογραφίες τμημάτων κρανίου εμβρύων Ε9.5, παρατηρήσαμε και πάλι αυξημένη χρώση με διάχυτη πυκνότητα ηλεκτρονίων σε μεταλλαγμένα έμβρυα Specc1l σε σύγκριση με το WT (Εικ. 5AA, BB και S1E-H).Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν τα in vitro αποτελέσματά μας σε κύτταρα SPECC1L-kd U2OS και υποδηλώνουν ότι η ανώμαλη χρώση AJ προηγείται της στρωματοποίησης CNCC στα μεταλλαγμένα έμβρυά μας.
Δεδομένης της γνωστής ανταγωνιστικής σχέσης μεταξύ της δραστηριότητας ΑΚΤ και της σταθερότητας της Ε-καντερίνης,17,28 υποθέσαμε τη συμμετοχή της σηματοδότησης PI3K-AKT.Επιπλέον, παρατηρήσαμε υποεπιδερμικές φουσκάλες σε ορισμένα από τα μεταλλαγμένα έμβρυά μας που διέφυγαν τη θνησιμότητα (<5%) στο E9,5-10,5 και αντ' αυτού εγκαταστάθηκαν περίπου στο E13,5 (Εικ. S3).Τα υποεπιδερμικά κυστίδια είναι χαρακτηριστικό γνώρισμα της μειωμένης σηματοδότησης PI3K-AKT με βάση το PDGFRα12.Οι Fantauzzo et al.(2014) ανέφερε ότι η διακοπή της ενεργοποίησης PI3K που βασίζεται σε PDGFRα σε μεταλλαγμένα έμβρυα PdgfraPI3K/PI3K έχει ως αποτέλεσμα υποεπιδερμικά κυστίδια, ελαττώματα νευρικού σωλήνα και φαινοτύπους σχιστίας υπερώας.Πράγματι, τα επίπεδα του pan-AKT και του ενεργού φωσφορυλιωμένου Ser473-AKT μειώθηκαν in vivo σε μεταλλαγμένους ιστούς Specc1l σε εμβρυϊκή διακοπή Ε9.5 (Εικ. 6A-D).Η μείωση στα επίπεδα του φωσφορυλιωμένου Ser473-AKT μπορεί να οφείλεται εξ ολοκλήρου στη μείωση των επιπέδων του pan-AKT in vivo (ΣΧΗΜΑ 6Ε) και in vitro (ΣΧΗΜΑ 6F).Μια in vitro μείωση παρατηρήθηκε μόνο όταν τα κύτταρα U2OS ήταν έντονα συρρέοντα με αλλαγές στο σχήμα των κυττάρων και στην πυκνότητα του AJ (Εικόνα 6D).Έτσι, τα δεδομένα μας υποδηλώνουν ότι το SPECC1L είναι ένας νέος θετικός ρυθμιστής της σηματοδότησης PI3K-AKT στην κρανιοπροσωπική μορφογένεση.
(A–E) E8.5 (A,B) και E9.5 (C,D) τομές κρανίου ή προϊόντα λύσης E9.5 από μεταλλαγμένα έμβρυα Specc1l (E) που δείχνουν επίπεδα ενεργού φωσφορυλιωμένου S473-AKT και μείωσης πρωτεΐνης pan-AKT , σε σύγκριση με τον έλεγχο WT.Η κηλίδωση Western πραγματοποιήθηκε σε προϊόντα λύσης άγριου τύπου και σε μεταλλαγμένα προϊόντα λύσης υπό τις ίδιες συνθήκες.Οι εικόνες που παρουσιάζονται για το SPECC1L ελήφθησαν από ένα στύπωμα.Το ίδιο στύπωμα αφαιρέθηκε και επανεξετάστηκε με αντισώματα anti-pan-ACT και β-ακτίνης.Τα επίπεδα Pan-AKT στις νευρικές πτυχές Ε8.5 (Α, Β) και τα επίπεδα φωσφορυλιωμένου S473-AKT σε τομές κρανίου Ε9.5 μειώθηκαν σημαντικά.(ΣΤ) Τα επίπεδα Pan-AKT μειώθηκαν παρομοίως σε προϊόντα λύσης κυττάρων SPECC1L-kd U2OS που συλλέχθηκαν σε υψηλή συρροή.Οι ράβδοι σφαλμάτων αντιπροσωπεύουν SEM από τρεις ανεξάρτητες ποσοτικοποιήσεις Western blot.(GJ) Τομές εμβρύων WT στο Ε9.5 χρωματίστηκαν με KI67 και διασπασμένη κασπάση 3, αντίστοιχα, εμφανίζοντας κυτταρικό πολλαπλασιασμό (G, G') και μικρή αποπτωτική δράση (Η, Η').Τα μεταλλαγμένα έμβρυα Specc11 εμφανίζουν συγκρίσιμο κυτταρικό πολλαπλασιασμό (Ι), αλλά ο αριθμός των κυττάρων που υφίστανται απόπτωση είναι σημαντικά αυξημένος (J).
Στη συνέχεια εξετάσαμε δείκτες πολλαπλασιασμού και απόπτωσης.Δεν παρατηρήσαμε καμία διαφορά στον πολλαπλασιασμό των εμβρύων Ε9,5 (Εικ. 6Ε, G σε σύγκριση με Ι) με δείκτη πολλαπλασιασμού 82,5% για μεταλλάγματα WT και 86,5% για μεταλλαγμένα Specc1l που μετρήθηκε με χρώση KI67 (p <0,56, Fisher's ακριβής δοκιμή).Παρομοίως, δεν παρατηρήσαμε καμία διαφορά στην απόπτωση που μετρήθηκε με χρώση για διασπασμένη κασπάση 3 σε νευρικές πτυχές στο E8,5 μέχρι τη διακοπή του εμβρύου (δεν φαίνεται) (δεν φαίνεται).Αντίθετα, η απόπτωση αυξήθηκε σημαντικά σε όλα τα μεταλλαγμένα έμβρυα Ε9.5 (Εικ. 6F, Η και J).Αυτή η συνολική αύξηση στην απόπτωση είναι σύμφωνη με τη μειωμένη σηματοδότηση PI3K-AKT και την πρώιμη εμβρυϊκή θνησιμότητα29,30,31.
Στη συνέχεια, για να επιβεβαιώσουμε έναν αιτιολογικό ρόλο για τη σηματοδότηση PI3K-AKT στις αλλαγές AJ στα kd κύτταρα μας, αλλάξαμε χημικά την οδό στα κύτταρα ελέγχου και kd (Εικόνα 7A-F).Χρησιμοποιήσαμε ως δείκτη τον φαινότυπο αλλαγής σχήματος κυττάρου που παρατηρήθηκε σε συρρέοντα κύτταρα SPECC1L-kd, τον οποίο ποσοτικοποιήσαμε χρησιμοποιώντας την αναλογία της μεγαλύτερης διάστασης (μήκος) προς την αντίστοιχη κατακόρυφη διάσταση (πλάτος).Αναλογία 1 αναμένεται για σχετικά στρογγυλά ή κυβοειδή κύτταρα (Εικόνα 7G).Εκτός από το σχήμα των κυττάρων, επιβεβαιώσαμε επίσης την επίδραση στο AJ με χρώση β-κατενίνης (Εικ. 7A'-F').Η αναστολή της οδού PI3K-AKT χρησιμοποιώντας wortmannin ήταν επαρκής για να αλλάξει το σχήμα των κυττάρων στα κύτταρα ελέγχου (Εικόνα 7Α, Γ) και AJ (Εικόνα 7Α').Ο ενεργοποιητής PI3K-AKT SC-79 δεν επηρέασε το σχήμα του κυττάρου (ΣΧΗΜΑ 7Α, Ε) ή την επέκταση AJ (ΣΧΗΜΑ 7Α') στα κύτταρα ελέγχου.Στα κύτταρα SPECC1L-kd, περαιτέρω καταστολή της οδού PI3K-AKT είχε ως αποτέλεσμα αυξημένη απόπτωση (Εικ. 7Β, D) και αξιοσημείωτη αύξηση στη χρώση β-κατενίνης (Εικ. 7Β'), σύμφωνα με τα in vivo βαριά μεταλλάγματα μας.Είναι σημαντικό ότι η ενεργοποίηση της οδού PI3K-AKT βελτίωσε σημαντικά το σχήμα των κυττάρων (Εικόνα 7B, F) και τους φαινοτύπους AJ (Εικόνα 7B").Οι αλλαγές στο σχήμα των κυττάρων ποσοτικοποιήθηκαν ως αναλογία στρογγυλότητας κυττάρου (CCR) και συγκρίθηκαν ως προς τη σημασία όπως περιγράφεται παραπάνω (ΣΧΗΜΑ 7G).Πράγματι, στα κύτταρα ελέγχου (Εικ. 7G, CCR = 1,56), η επεξεργασία με wortmannin ήταν επαρκής για να αλλάξει σημαντικά το σχήμα των κυττάρων (Εικ. 7G, CCR = 3,61, p < 2,4 × 10-9) σε βαθμό παρόμοιο με αυτόν που παρατηρήθηκε σε SPECC1L.-kd κύτταρα (Εικ. 7G, CCR = 3,46).Η επεξεργασία με wortmannin των SPECC1L-kd κυττάρων (Εικ. 7G, CCR = 3,60, αμελητέα) δεν ήταν πιο σημαντική από τα μη επεξεργασμένα κύτταρα kd (Εικ. 7G, CCR = 3,46, αμελητέα) ή τα κύτταρα ελέγχου που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με wortmannin (Εικ. 7G)., CCR = 3,46, αμελητέα) επηρεάζει επιπλέον την επιμήκυνση των κυττάρων (7G, CCR = 3,61, αμελητέα).Το πιο σημαντικό, ο ενεργοποιητής SC-79 AKT αποκατέστησε τον επιμήκη φαινότυπο των κυττάρων SPECC1L-kd (Εικ. 7G, CCR = 1,74, p < 6,2 × 10-12).Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν ότι το SPECC1L ρυθμίζει τη σηματοδότηση PI3K-AKT και υποδηλώνουν ότι μια μέτρια μείωση του SPECC1L επηρεάζει την κυτταρική προσκόλληση, ενώ μια ισχυρή μείωση οδηγεί σε απόπτωση (Εικ. 8).
(A–F') Κύτταρα ελέγχου (A, C, E) και SPECC1L-kd (B, D, F) που υποβλήθηκαν σε αγωγή με αναστολέα οδού PI3K-AKT wortmannin (C, D) ή SC-79 ενεργοποιητή (E, F) Θεραπεία Τα μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου είναι κυβοειδή (Α) με φυσιολογική κυτταρική χρώση β-γάτας (Α'), ενώ τα κύτταρα kd είναι επιμήκη (Β) με αυξημένη χρώση β-γάτας (Β').Μετά την καταστολή της οδού PI3K-AKT, τα κύτταρα ελέγχου επιμηκύνθηκαν (C) με επέκταση β-γάτας (C'), ενώ τα κύτταρα kd άρχισαν να υφίστανται απόπτωση (D), παρόμοια με τα εξαιρετικά μεταλλαγμένα έμβρυά μας και παρουσιάζοντας εξαιρετικά ενισχυμένη β-γάτα.χρώση (Δ').Μετά την ενεργοποίηση της οδού PI3K-AKT, τα κύτταρα ελέγχου παρέμειναν κυβοειδή (Ε) και είχαν φυσιολογική χρώση β-γάτας (Ε'), ενώ τα κύτταρα kd παρουσίασαν σημαντικά βελτιωμένο σχήμα κυττάρου (F) και χρώση β-γάτας (F'), υποδεικνύοντας (Ζ) Ο βαθμός αλλαγής του σχήματος κυψέλης στο (AF) ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τον λόγο στρογγυλότητας κυψέλης (CCR) της μεγαλύτερης διάστασης (μήκος) και της αντίστοιχης κάθετης διάστασης (πλάτους) χρησιμοποιώντας το λογισμικό MetaMorph.Τα μη επεξεργασμένα (NT) SPECC1L-kd κύτταρα (CCR = 3,46) ήταν σημαντικά μεγαλύτερα από τα κύτταρα ελέγχου (CCR = 1,56, p < 6,1 × 10-13).Η αναστολή του Wort της οδού PI3K-AKT στα κύτταρα ελέγχου ήταν επαρκής για να προκαλέσει παρόμοια επιμήκυνση στο σχήμα των κυττάρων (CCR=3,61, p<2,4×10-9).Ομοίως, η ενεργοποίηση AKT από το SC-79 σε κύτταρα SPECC1L-kd αποκατέστησε την επιμήκυνση των κυττάρων σε επίπεδα ελέγχου (CCR = 1,74, p < 6,2 × 10-12).Η επεξεργασία με wortmannin των SPECC1L-kd κυττάρων είχε ως αποτέλεσμα αυξημένη απόπτωση αλλά όχι περαιτέρω αύξηση στην αλλαγή του σχήματος των κυττάρων (CCR=3,60) σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου που δεν υποβλήθηκαν σε αγωγή (CCR=3,46, ns) ή τα κύτταρα ελέγχου που υποβλήθηκαν σε αγωγή με wortmannin (3,61).ns = δεν έχει σημασία.Εμφανίζονται +/- μετρήσεις SEM για 50 κύτταρα.Οι στατιστικές διαφορές υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας το Student's t-test.
(Α) Σχηματική αναπαράσταση της αναστολής και της ενεργοποίησης της οδού PI3K-AKT που οδηγεί σε αλλαγές AJ και διάσωση, αντίστοιχα.(Β) Προτεινόμενο μοντέλο για σταθεροποίηση πρωτεΐνης AKT με SPECC1L.
Τα προμεταναστευτικά CNCC απαιτούν λύση AJ για διαχωρισμό από τα νευροεπιθηλιακά κύτταρα της πρόσθιας νευρικής πτυχής1,15,32.Η αυξημένη χρώση των συστατικών AJ και η απώλεια της κορυφαίας-βασικής ασύμμετρης κατανομής AJ σε κύτταρα με έλλειψη SPECC1L τόσο in vitro όσο και in vivo, σε συνδυασμό με τη φυσική εγγύτητα του SPECC1L στη β-κατενίνη, υποδηλώνουν ότι το SPECC1L λειτουργεί για να διατηρεί σωστά την τοπική σταθερότητα του AJ για μύες οργάνωσης.κυτταροσκελετός ακτίνης.Η συσχέτιση του SPECC1L με τον κυτταροσκελετό ακτίνης και τη β-κατενίνη και η αύξηση του αριθμού των συμπυκνωμένων νημάτων ακτίνης απουσία του SPECC1L είναι συνεπής με την παρατηρούμενη αύξηση στην πυκνότητα του AJ.Μια άλλη πιθανότητα είναι ότι ένας αυξημένος αριθμός ινών ακτίνης σε κύτταρα με έλλειψη SPECC1L οδηγεί σε αλλαγή στη μεσοκυττάρια τάση.Επειδή η κυτταρική καταπόνηση επηρεάζει τη δυναμική του AJ 33, οι αλλαγές τάσης μπορούν να οδηγήσουν σε πιο διάχυτο AJ 34 .Έτσι, τυχόν αλλαγές θα επηρεάσουν τα επίπεδα CNCC.
Το Wnt1 εκφράζεται στις πρώιμες νευρικές πτυχές που δημιουργούν κύτταρα νευρικής ακρολοφίας.Έτσι, η ανίχνευση γενεαλογίας Wnt1-cre σηματοδοτεί τόσο το NCC35 πριν όσο και το μεταναστευτικό.Ωστόσο, το Wnt1 σηματοδοτεί επίσης κλώνους ραχιαίου εγκεφαλικού ιστού που προέρχονται επίσης από πρώιμες νευρικές πτυχές 35,36, καθιστώντας πιθανό ότι η χρώση των μεταλλαγμάτων Ε9.5 για δείκτες Wnt1 σε ανοιχτές νευρικές πτυχές δεν είναι CNCC.Η θετική μας χρώση για τους δείκτες NCC AP2A και SOX10 επιβεβαίωσε ότι οι εκτεθειμένες νευρικές πτυχές των μεταλλαγμένων εμβρύων Specc11 περιείχαν πράγματι CNCC.Επιπλέον, δεδομένου ότι τα AP2A και SOX10 είναι δείκτες πρώιμου μεταναστευτικού NCC, η θετική χρώση έδειξε ότι αυτά τα κύτταρα είναι μετα-μεταναστευτικά CNCC που δεν μπορούν να στρωματοποιηθούν από το E9.5.
Τα δεδομένα μας υποδηλώνουν ότι η μοριακή ρύθμιση του AJ από το SPECC1L μεσολαβείται από τη σηματοδότηση PI3K-AKT.Η σηματοδότηση AKT μειώνεται σε κύτταρα και ιστούς με έλλειψη SPECC1L.Ευρήματα από Fantauzzo et al.υποστηρίζουν έναν άμεσο ρόλο για τη σηματοδότηση PI3K-AKT στην κρανιοπροσωπική μορφογένεση.(2014) έδειξε ότι η έλλειψη ενεργοποίησης της σηματοδότησης PI3K-AKT που βασίζεται σε PDGFRα οδηγεί σε φαινότυπο σχιστίας υπερώας.Δείχνουμε επίσης ότι η αναστολή της οδού PI3K-AKT είναι επαρκής για να αλλάξει το σχήμα AJ και το σχήμα των κυττάρων στα κύτταρα U2OS.Σε συμφωνία με τα ευρήματά μας, οι Cain et al.37 έδειξε ότι η προς τα κάτω ρύθμιση της υπομονάδας PI3K α110 στα ενδοθηλιακά κύτταρα έχει ως αποτέλεσμα παρόμοια αύξηση στην περικυτταρική χρώση β-κατενίνης, που αναφέρεται ως αύξηση στον «δείκτη συνδεσιμότητας».Ωστόσο, σε ενδοθηλιακά κύτταρα των οποίων τα νημάτια ακτίνης είναι ήδη πολύ οργανωμένα, η καταστολή της οδού PI3K-AKT έχει ως αποτέλεσμα ένα χαλαρό σχήμα κυττάρου.Αντίθετα, τα κύτταρα SPECC1L-kd U2OS έδειξαν ένα επιμήκη σχήμα κυττάρου.Αυτή η διαφορά μπορεί να είναι συγκεκριμένη για τον τύπο κυττάρου.Ενώ η καταστολή της σηματοδότησης PI3K-AKT επηρεάζει μόνιμα τον κυτταροσκελετό της ακτίνης, η επίδραση στο σχήμα των κυττάρων καθορίζεται από αλλαγές στην τάση που προκαλούνται από αλλαγές στην πυκνότητα και την οργάνωση των κεντρικών ινών ακτίνης.Στα κύτταρα U2OS, χρησιμοποιήσαμε μόνο αλλαγές σχήματος κελιών ως δείκτη αλλαγής και ανάκτησης AJ με έλλειψη SPECC1L.Συμπερασματικά, υποθέτουμε ότι η αναστολή της οδού AKT στην ανεπάρκεια SPECC1L αυξάνει τη σταθερότητα του AJ και μειώνει την αποκόλληση στο CNCC.
Είναι ενδιαφέρον ότι τα επίπεδα pan-AKT μειώθηκαν in vitro και in vivo επιπλέον των φωσφορυλιωμένων επιπέδων 473-AKT απουσία SPECC1L, υποδηλώνοντας ρύθμιση της σηματοδότησης PI3K-AKT στο επίπεδο σταθερότητας ή ανακύκλωσης της πρωτεΐνης AKT.Τα γονίδια SPECC1L και MID1, που σχετίζονται και τα δύο με το σύνδρομο Opitz/GBBB, κωδικοποιούν πρωτεΐνες που σταθεροποιούν τους μικροσωληνίσκους 18,22.Ο μηχανισμός με τον οποίο τα SPECC1L και MID1 μεσολαβούν στη σταθεροποίηση των μικροσωληνίσκων δεν είναι πλήρως κατανοητός.Στην περίπτωση του SPECC1L, αυτή η σταθεροποίηση περιλαμβάνει ενισχυμένη ακετυλίωση μιας υποομάδας μικροσωληνίσκων 18 .Είναι πιθανό το SPECC1L να χρησιμοποιεί παρόμοιο μηχανισμό για τη σταθεροποίηση άλλων πρωτεϊνών όπως το AKT.Έχει αποδειχθεί ότι η ακετυλίωση των υπολειμμάτων λυσίνης στην πρωτεΐνη AKT οδηγεί σε μείωση του εντοπισμού της μεμβράνης και της φωσφορυλίωσης38.Επιπλέον, απαιτείται ουμπικουϊτινοποίηση της αλυσίδας Κ63 στο ίδιο υπόλειμμα λυσίνης στο AKT για τον εντοπισμό και την ενεργοποίησή της στη μεμβράνη39,40.Μεταξύ πολλών παραγόντων που αλληλεπιδρούν με πρωτεΐνες SPECC1L που εντοπίστηκαν σε διάφορες οθόνες δύο υβριδίων ζυμομύκητα υψηλής απόδοσης, τέσσερις - CCDC841, ECM2942, APC και UBE2I43 - έχουν εμπλακεί στην ανακύκλωση ή τη σταθερότητα πρωτεΐνης μέσω ουβικουϊτινοποίησης ή σουμοϋλίωσης.Το SPECC1L μπορεί να εμπλέκεται στη μετα-μεταφραστική τροποποίηση των υπολειμμάτων λυσίνης AKT, επηρεάζοντας τη σταθερότητα του AKT.Ωστόσο, ο κρίσιμος ρόλος του SPECC1L στον εντοπισμό και τη σταθερότητα της πρωτεΐνης AKT παραμένει να διευκρινιστεί.
Σοβαρά ελαττώματα στην έκφραση του SPECC1L in vivo είχαν ως αποτέλεσμα αυξημένη χρώση δείκτη AJ και ελαττωματική επικάλυψη CNCC, καθώς και αυξημένη απόπτωση και πρώιμη εμβρυϊκή θνησιμότητα.Προηγούμενες αναφορές έχουν δείξει ότι μεταλλάξεις ποντικών με αυξημένα επίπεδα απόπτωσης σχετίζονται με ελαττώματα του νευρικού σωλήνα 44,45,46,47 και κρανιοπροσωπικά ελαττώματα48.Έχει προταθεί ότι ο υπερβολικός κυτταρικός θάνατος στις νευρικές πτυχές ή στις φαρυγγικές καμάρες μπορεί να οδηγήσει σε ανεπαρκή αριθμό κυττάρων που απαιτούνται για τη σωστή μορφογενετική κίνηση 48,49,50.Αντίθετα, οι κυτταρικές σειρές μας με ανεπάρκεια SPECC1L με μέτρια μειωμένη έκφραση SPECC1L έδειξαν μόνο αλλαγές AJ χωρίς στοιχεία αυξημένου κυτταρικού θανάτου.Ωστόσο, η χημική αναστολή της οδού PI3K-AKT σε αυτά τα κύτταρα Kd οδήγησε σε αυξημένη απόπτωση.Έτσι, μια μέτρια μείωση στην έκφραση ή λειτουργία του SPECC1L εξασφαλίζει την επιβίωση των κυττάρων.Αυτό είναι σύμφωνο με την παρατήρηση ότι σπάνια μεταλλαγμένα έμβρυα Specc11 που διαφεύγουν τη σύλληψη στο st.Το E9.5 —ίσως λόγω μειωμένης αποτελεσματικότητας σύλληψης γονιδίων— μπορεί να κλείσει τους νευρικούς σωλήνες και να σταματήσει αργότερα στην ανάπτυξη, συχνά με κρανιοπροσωπικά ελαττώματα (Εικ. S3).Επίσης συνάδει με αυτό είναι η σπάνια εμφάνιση ετερόζυγων εμβρύων Specc1l με κρανιοπροσωπικές ανωμαλίες —πιθανώς λόγω αυξημένης αποτελεσματικότητας σύλληψης γονιδίων— καθώς και το εύρημα σε ζέβρα όπου ένας από τους δύο ορθολόγους SPECC1L (specc1lb) προκαλεί καθυστερημένη εμβρυϊκή απώλεια φαινοτύπων. κάτω γνάθοι και αμφοτερόπλευρες σχιστίες51.Έτσι, ετερόζυγες μεταλλάξεις απώλειας λειτουργίας του SPECC1L που εντοπίστηκαν σε ανθρώπους ασθενείς μπορεί να προκαλέσουν μικρές βλάβες στη λειτουργία του SPECC1L κατά τη διάρκεια της κρανιοπροσωπικής μορφογένεσης, επαρκείς για να εξηγήσουν τις στοματοπροσωπικές σχιστίες τους.Η ρύθμιση των μεσοκυττάριων επαφών με βάση το SPECC1L μπορεί επίσης να παίζει ρόλο στην παλατογένεση και τη σύντηξη των φαρυγγικών τόξων.Περαιτέρω μελέτες της λειτουργίας SPECC1L θα βοηθήσουν στην αποσαφήνιση του ρόλου των προσωρινών μεσοκυττάριων επαφών στο CNCC κατά το κλείσιμο του νευρικού σωλήνα στην κινητικότητα των νευροεπιθηλιακών κυττάρων και στην κρανιοπροσωπική μορφογένεση.
Ο έλεγχος του οστεοσαρκώματος U2OS και τα κύτταρα SPECC1L-kd έχουν περιγραφεί προηγουμένως (Saadi et al., 2011).Τα αντισώματα κατά του SPECC1L έχουν επίσης χαρακτηριστεί στο παρελθόν (Saadi et al., 2011).Αντισώματα κατά της β-κατενίνης (κουνέλι; 1:1000; Santa Cruz, Dallas, TX) (ποντίκι; 1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), μυοσίνη IIb (1:1000; Sigma-Aldrich, St. Louis ) , MO) ), E-cadherin (1:1000; Abkam, Cambridge, MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, Colo.), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, Σαν Ντιέγκο , California), DLX2 (1:1000; Abcam, Cambridge, MA), phospho-Ser473-AKT (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), pan-AKT (1:1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA ), KI67 (1:1000· Cell Signaling Technology, Danvers, MA), διασπασμένη κασπάση 3 (1:1000· Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ) και β-ακτίνη (1:2500· Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ) χρησιμοποιήθηκε όπως περιγράφεται..Τα νήματα ακτίνης χρωματίστηκαν με ροδαμίνη φαλλοιδίνη Acti-stain (Cytoskeleton, Denver, Colorado).
Κύτταρα ελέγχου U2OS και κύτταρα SPECC1L-kd καλλιεργήθηκαν σε τυπικό DMEM υψηλής γλυκόζης συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (Life Technologies, Carlsbad, CA).Για αλλαγές AJ, 2 χ 105 κύτταρα σπάρθηκαν σε γυαλί επεξεργασμένο με 0,1% ζελατίνη χοίρου (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ) και παρατηρήθηκαν για αλλαγές στο σχήμα των κυττάρων.Τα κύτταρα συλλέχθηκαν σε διαφορετικά υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία: 4 ώρες μετά τη σπορά (t = 1), 24 ώρες μετά τη σπορά (t = 2), συρροή χωρίς αλλαγή στο σχήμα των κυττάρων (t = 3), αλλαγή στο σχήμα των κυττάρων (t = 4) , 24 ώρες μετά την αλλαγή του σχήματος του κελιού (t = 5) και 48 ώρες μετά την αλλαγή του σχήματος του κελιού (t = 6) (Εικ. 1, 2, 3).Για τη ρύθμιση της οδού PI3K-AKT, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις με τον αναστολέα PI3K-AKT wortmannin (TOCRIS Biosciences, Minneapolis, Minnesota) ή ενεργοποιητή SC-79 (TOCRIS Biosciences, Minneapolis Adams, Minnesota).Το μέσο που περιείχε τις χημικές ουσίες άλλαζε καθημερινά.
Εγγραφές καρέ-καρέ έγιναν σε ζωντανά κύτταρα ελέγχου και KD υπό κανονικές συνθήκες καλλιέργειας και συλλέγονταν εικόνες αντίθεσης φάσης κάθε 10 λεπτά για 7 ημέρες.Οι εικόνες ελήφθησαν χρησιμοποιώντας ένα ελεγχόμενο από υπολογιστή ανεστραμμένο μικροσκόπιο Leica DM IRB εξοπλισμένο με μηχανικό στάδιο και αντικειμενικό φακό 10 × N-PLAN συνδεδεμένο με κάμερα QImaging Retiga-SRV.Κατά τη διάρκεια της απεικόνισης, οι κυτταροκαλλιέργειες διατηρήθηκαν στους 37°C σε υγρή ατμόσφαιρα με 5% CO2.
Δύο κυτταρικές σειρές ES παγίδας γονιδίων DTM096 και RRH048 από το Regional Mutant Mouse Resource Center (UC Davis, CA) χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία σειρών ποντικών με ανεπάρκεια Specc11, που ονομάζονται Specc1lgtDTM096 και Spec1lgtRRH046.Εν συντομία, κύτταρα 129/REJ ES εγχύθηκαν σε βλαστοκύστες C57BL6.Τα προκύπτοντα χιμαιρικά αρσενικά ποντίκια εκτράφηκαν με θηλυκά ποντίκια C57BL6 για να ταυτοποιηθούν οι απόγονοι με χρωματισμό επικάλυψης agouti.Η παρουσία ενθέτων φορέα γονιδιακής παγίδας χρησιμοποιήθηκε για την ταυτοποίηση ετεροζυγώτων.Τα ποντίκια διατηρήθηκαν σε μικτό υπόβαθρο 129/REJ;C57BL6.Η θέση της θέσης εισαγωγής του φορέα γενετικής παγίδας επιβεβαιώθηκε με RT-PCR, προσδιορισμό αλληλουχίας γονιδιώματος και γενετική συμπλήρωση (Συμπληρωματικό Σχήμα 1).Για την ανίχνευση της γενεαλογίας CNCC των διπλών ετερόζυγων ποντικών Spec1lGT, διασταυρώθηκαν ποντίκια ROSAmTmG (#007576) και Wnt1-Cre (#003829) (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) για να παραχθεί το ROSAmTmG και το WntTmG και το WntTmG και το Wnt1-Creo.Όλα τα πειράματα σε ποντίκια πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με πρωτόκολλα εγκεκριμένα από την Επιτροπή Ιδρυματικής Φροντίδας και Χρήσης Ζώων του Ιατρικού Κέντρου του Πανεπιστημίου του Κάνσας.
Τα έμβρυα σταθεροποιήθηκαν σε (1% φορμαλδεΰδη, 0,2% γλουταραλδεΰδη, 2 mM MgCl2, 0,02% NP-40, 5 mM EGTA) για 60 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου.Μετά από μονιμοποίηση σε διάλυμα χρώσης X-gal (5 mM σιδηροκυανιούχο κάλιο, 5 mM σιδηροκυανιούχο κάλιο, 2 mM MgCl2, 0,01% δεοξυχολικό νάτριο, 0,02% NP-40, 1 mg/ml X-gal) Η ανάπτυξη χρώσης πραγματοποιήθηκε στους 37°C .°C μέσα σε 1-6 ώρες.Τα έμβρυα μονιμοποιήθηκαν εκ των υστέρων σε 4% PFA και οπτικοποιήθηκαν.
Για στύπωμα Western, τα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα παθητικής λύσης (Promega, Fitchburg, WI) συμπληρωμένο με ένα μίγμα αναστολέων πρωτεάσης HALT (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ).Τα προϊόντα λύσης υποβλήθηκαν σε επεξεργασία σε έτοιμα πηκτώματα 12% πολυακρυλαμιδίου Mini-PROTEAN TGX (Bio-Rad, Hercules, CA) και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες Immobilon PVDF (EMD Millipore, Billerica, ΜΑ).Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν σε 5% γάλα σε PBS που περιείχε 0,1% Tween.Τα αντισώματα επωάστηκαν όλη τη νύχτα στους 4°C ή για μία ώρα σε θερμοκρασία δωματίου.Το αντιδραστήριο Femto SuperSignal West ECL (Thermo Scientific, Waltham, ΜΑ) χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία σήματος.Για ανοσοχρώση, τα έμβρυα σταθεροποιήθηκαν όλη τη νύχτα σε 4% PFA/PBS και κρυοσυντηρήθηκαν.Οι κρυοτομές ιστών αποκλείστηκαν σε PBS που περιείχε 1% φυσιολογικό ορό κατσίκας (Thermo Scientific, Waltham, MA) και 0,1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) και στη συνέχεια επωάστηκαν στους 4°C σε επωαστήρα κατά τη διάρκεια της Νύχτα.με αντι-αντίσωμα και φθορίζον δευτερεύον αντίσωμα (1:1000) για 1 ώρα στους 4°C.Οι χρωματισμένες τομές τοποθετήθηκαν σε μέσο χρυσού ProLong (Thermo Scientific, Waltham ΜΑ) και λήφθηκαν επίπεδες εικόνες χρησιμοποιώντας ομοεστιακό μικροσκόπιο Leica TCS SPE.Κάθε ανοσοχρώση πραγματοποιήθηκε ως τρία ανεξάρτητα πειράματα σε τομές τουλάχιστον δύο μεταλλαγμένων εμβρύων.Παρουσιάζεται ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα.
Τα κύτταρα επωάστηκαν σε τροποποιημένο ρυθμιστικό διάλυμα RIPA (20 mM Tris-HCl, ρΗ 8,0, 1% NP-40, 130 mM NaCl, 10% γλυκερίνη, 2 mM EDTA και αναστολέας πρωτεάσης HALT (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ) Εν συντομία, τα προϊόντα λύσης προκαθαρίστηκαν με μαγνητικά σφαιρίδια πρωτεΐνης G (Life Technologies, Carlsbad, CA) και στη συνέχεια επωάστηκαν όλη τη νύχτα στους 4° C. Χρησιμοποιήθηκαν σφαιρίδια πρωτεΐνης G πρωτεΐνης G αντι-SPECC1L για την εκχύλιση του SPECC1L και blotting Western πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το αντι Αντίσωμα -β-κατενίνης που περιγράφεται παραπάνω Τα πειράματα συν-ΙΡ που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τεσσάρων ανεξάρτητων πειραμάτων.
Σταθεροποιημένα καλλιεργημένα κύτταρα ή εμβρυϊκοί ιστοί ποντικού παρασχέθηκαν στο κέντρο ηλεκτρονικής μικροσκοπίας στο Ιατρικό Κέντρο του Πανεπιστημίου του Κάνσας.Εν συντομία, τα δείγματα ενσωματώθηκαν σε ρητίνη EMbed 812 (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, ΡΑ), πολυμερίστηκαν όλη τη νύχτα στους 60°C και τεμαχίστηκαν στα 80 nm χρησιμοποιώντας έναν υπερμικρότομο Leica UC7 εξοπλισμένο με λεπίδα διαμαντιού.Οι τομές οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ηλεκτρονικό μικροσκόπιο μετάδοσης JEOL JEM-1400 εξοπλισμένο με πιστόλι Lab6 100 kV.
Πώς να αναφέρετε αυτό το άρθρο: Wilson, NR et al.Η ανεπάρκεια του SPECC1L οδηγεί σε αυξημένη σταθερότητα των ματισμένων αρθρώσεων και μειωμένη αποκόλληση των κυττάρων της κρανιακής νευρικής ακρολοφίας.η επιστήμη.6, 17735;doi:10.1038/srep17735 (2016).
Saint-Jeanne, J.-P.Επαγωγή και διαφοροποίηση της νευρικής ακρολοφίας.(Springer Science + Business Media; Landes Bioscience/Eurekah.com, 2006).
Cordero, DR et al.Κύτταρα κρανιακής νευρικής ακρολοφίας σε κίνηση: ο ρόλος τους στην κρανιοπροσωπική ανάπτυξη.American Journal of Medical Genetics.Μέρος Α 155A, 270–279, doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
Boland, RP Neurocristopathia: ανάπτυξη και ανάπτυξή της για 20 χρόνια.Παιδίατρος.παθολογία.εργαστήριο.φάρμακο.17, 1–25 (1997).
Mangold E., Ludwig KU και Noten MM Ανακάλυψη στη γενετική των στοματοπροσωπικών σχισμών.Trends in Molecular Medicine 17, 725–733, doi:10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
Minu, M. and Riley, FM Μοριακοί μηχανισμοί μετανάστευσης και διαμόρφωσης κυττάρων κρανιακής νευρικής ακρολοφίας κατά τη διάρκεια της κρανιοπροσωπικής ανάπτυξης.Development 137, 2605–2621, doi: 10.1242/dev.040048 (2010).
Dixon, MJ, Marazita, ML, Beaty, TH and Murray, JK Σχισμό χείλους και υπερώας: κατανόηση των γενετικών και περιβαλλοντικών επιρροών.φυσικό σχόλιο.Genetics 12, 167–178, doi: 10.1038/nrg2933 (2011).
Ingram, CR et αϊ.Μη φυσιολογική μορφογένεση του δέρματος, των άκρων και της κρανιοπροσωπικής περιοχής σε ποντίκια με έλλειψη ιντερφερόνης παράγοντα-6 (Irf6).National Genette.38, 1335–1340, doi: 10.1038/ng1903 (2006).
Peyrard-Janvid, Μ. et al.Οι κυρίαρχες μεταλλάξεις στο GRHL3 προκαλούν σύνδρομο van der Waord και βλάπτουν την ανάπτυξη του στοματικού περιδέρματος.Am J Hum Genet 94, 23–32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
Harris, MJ και Juriloff, DM Ενημερώστε τη λίστα των μεταλλαγμένων ποντικών με ελαττώματα στο κλείσιμο του νευρικού σωλήνα και προχωρήστε προς την πλήρη γενετική κατανόηση του κλεισίματος του νευρικού σωλήνα.Διερεύνηση γενετικών ανωμαλιών.Part A, Clinical and Molecular Teratology 88, 653–669, doi: 10.1002/bdra.20676 (2010).
Fantauzzo, KA & Soriano, P. Η σηματοδότηση PDGFRalpha με τη μεσολάβηση PI3K ρυθμίζει την επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό στη σκελετική ανάπτυξη μέσω μιας εξαρτώμενης από το p53 ενδοκυτταρικής οδού.Gene Development 28, 1005–1017, doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014).
Kopp, AJ, Green, ND και Murdoch, JN Disheveled: Σχέση συγκλίνουσας επέκτασης με το κλείσιμο του νευρικού σωλήνα.Τάσεις στη νευρολογία.26, 453–455, doi: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003).