Σας ευχαριστούμε που επισκεφτήκατε το Nature.com.Χρησιμοποιείτε μια έκδοση προγράμματος περιήγησης με περιορισμένη υποστήριξη CSS.Για την καλύτερη εμπειρία, συνιστούμε να χρησιμοποιήσετε ένα ενημερωμένο πρόγραμμα περιήγησης (ή να απενεργοποιήσετε τη λειτουργία συμβατότητας στον Internet Explorer).Επιπλέον, για να διασφαλίσουμε τη συνεχή υποστήριξη, εμφανίζουμε τον ιστότοπο χωρίς στυλ και JavaScript.
Ρυθμιστικά που εμφανίζουν τρία άρθρα ανά διαφάνεια.Χρησιμοποιήστε τα κουμπιά πίσω και επόμενο για να μετακινηθείτε στις διαφάνειες ή τα κουμπιά του ελεγκτή ολίσθησης στο τέλος για να μετακινηθείτε σε κάθε διαφάνεια.

317 Προμηθευτές σωλήνων πηνίου από ανοξείδωτο χάλυβα

Πίνακας χημικής σύνθεσης από ανοξείδωτο υλικό

Η SPACA6 είναι μια επιφανειακή πρωτεΐνη που εκφράζεται από το σπέρμα και είναι κρίσιμη για τη σύντηξη γαμετών κατά τη σεξουαλική αναπαραγωγή θηλαστικών.Παρά αυτόν τον θεμελιώδη ρόλο, η συγκεκριμένη λειτουργία του SPACA6 είναι ελάχιστα κατανοητή.Διασαφηνίζουμε την κρυσταλλική δομή της εξωκυτταρικής περιοχής του SPACA6 σε ανάλυση 2,2 Α, αποκαλύπτοντας μια πρωτεΐνη δύο τομέων που αποτελείται από μια τετράκλωνη δέσμη και β-σάντουιτς τύπου Ig που ενώνονται με οιονεί εύκαμπτους συνδέτες.Αυτή η δομή μοιάζει με το IZUMO1, μια άλλη πρωτεΐνη που σχετίζεται με τη σύντηξη γαμετών, καθιστώντας τα SPACA6 και IZUMO1 ιδρυτικά μέλη της υπεροικογένειας πρωτεϊνών που σχετίζονται με τη γονιμοποίηση που αναφέρεται εδώ ως υπεροικογένεια IST.Η υπεροικογένεια IST ορίζεται δομικά από τη συστραμμένη δέσμη τεσσάρων έλικας και ένα ζευγάρι μοτίβων CXXC που συνδέονται με δισουλφίδιο.Μια έρευνα με βάση τη δομή του AlphaFold του ανθρώπινου πρωτεώματος εντόπισε επιπλέον πρωτεϊνικά μέλη αυτής της υπεροικογένειας.Συγκεκριμένα, πολλές από αυτές τις πρωτεΐνες εμπλέκονται στη σύντηξη γαμετών.Η δομή SPACA6 και η σχέση της με άλλα μέλη της υπεροικογένειας IST παρέχουν τον κρίκο που λείπει στη γνώση μας για τη σύντηξη γαμετών θηλαστικών.
Κάθε ανθρώπινη ζωή ξεκινά με δύο ξεχωριστούς απλοειδείς γαμέτες: το σπέρμα του πατέρα και το ωάριο της μητέρας.Αυτό το σπέρμα είναι ο νικητής μιας έντονης διαδικασίας επιλογής κατά την οποία εκατομμύρια σπερματοζωάρια περνούν από τη γυναικεία γεννητική οδό, ξεπερνούν διάφορα εμπόδια1 και υφίστανται χωρητικότητα, η οποία ενισχύει την κινητικότητά τους και τη διαδικασία των επιφανειακών συστατικών2,3,4.Ακόμα κι αν το σπέρμα και το ωάριο βρουν το ένα το άλλο, η διαδικασία δεν έχει ακόμη τελειώσει.Το ωοκύτταρο περιβάλλεται από ένα στρώμα σωρευτικών κυττάρων και ένα φράγμα γλυκοπρωτεΐνης που ονομάζεται διαφανής ζώνη, μέσω του οποίου πρέπει να περάσει το σπέρμα για να εισέλθει στο ωάριο.Τα σπερματοζωάρια χρησιμοποιούν έναν συνδυασμό μορίων επιφανειακής προσκόλλησης και ενζύμων που σχετίζονται με τη μεμβράνη και εκκρίνονται για να ξεπεράσουν αυτά τα τελικά εμπόδια5.Αυτά τα μόρια και τα ένζυμα αποθηκεύονται κυρίως στην εσωτερική μεμβράνη και στην ακροσωμική μήτρα και ανιχνεύονται όταν η εξωτερική μεμβράνη του σπέρματος λύεται κατά τη διάρκεια της ακροσωμικής αντίδρασης6.Το τελευταίο βήμα σε αυτό το έντονο ταξίδι είναι το γεγονός σύντηξης σπέρματος-ωαρίου, στο οποίο τα δύο κύτταρα συγχωνεύουν τις μεμβράνες τους για να γίνουν ένας ενιαίος διπλοειδής οργανισμός7.Αν και αυτή η διαδικασία είναι πρωτοποριακή στην ανθρώπινη αναπαραγωγή, οι απαραίτητες μοριακές αλληλεπιδράσεις είναι ελάχιστα κατανοητές.
Εκτός από τη γονιμοποίηση γαμετών, έχει μελετηθεί εκτενώς η χημεία της σύντηξης δύο λιπιδικών διπλών στοιβάδων.Γενικά, η σύντηξη μεμβράνης είναι μια ενεργειακά δυσμενής διαδικασία που απαιτεί από έναν πρωτεϊνικό καταλύτη να υποστεί μια αλλαγή δομικής διαμόρφωσης που φέρνει δύο μεμβράνες πιο κοντά μεταξύ τους, σπάζοντας τη συνέχειά τους και προκαλώντας σύντηξη8,9.Αυτοί οι πρωτεϊνικοί καταλύτες είναι γνωστοί ως συντηκτογόνα και έχουν βρεθεί σε αμέτρητα συστήματα σύντηξης.Απαιτούνται για την είσοδο του ιού στα κύτταρα-ξενιστές (π.χ. gp160 στον HIV-1, ακίδα στους κοροναϊούς, αιμοσυγκολλητίνη στους ιούς της γρίπης)10,11,12 πλακούντα (συνκυτίνη)13,14,15 και συντήξεις που σχηματίζουν γαμετές σε κατώτερους ευκαρυώτες ( HAP2/GCS1 σε φυτά, πρωτίστες και αρθρόποδα) 16,17,18,19.Τα συντηγόνα για ανθρώπινους γαμέτες δεν έχουν ακόμη ανακαλυφθεί, αν και αρκετές πρωτεΐνες έχουν αποδειχθεί ότι είναι κρίσιμες για την προσκόλληση και τη σύντηξη γαμετών.Το CD9 που εκφράζεται σε ωάρια, μια διαμεμβρανική πρωτεΐνη που απαιτείται για τη σύντηξη γαμετών ποντικού και ανθρώπου, ήταν το πρώτο που ανακαλύφθηκε 21,22,23.Αν και η ακριβής λειτουργία του παραμένει ασαφής, ο ρόλος στην προσκόλληση, η δομή των εστιών προσκόλλησης στις μικρολάχνες του αυγού ή/και ο σωστός εντοπισμός των πρωτεϊνών της επιφάνειας των ωαρίων φαίνεται πιθανός 24,25,26.Οι δύο πιο τυπικές πρωτεΐνες που είναι κρίσιμες για τη σύντηξη γαμετών είναι η πρωτεΐνη σπέρματος IZUMO127 και η πρωτεΐνη ωοκυττάρου JUNO28, και η αμοιβαία συσχέτιση τους είναι ένα σημαντικό βήμα στην αναγνώριση και προσκόλληση γαμετών πριν από τη σύντηξη.Τα αρσενικά ποντίκια νοκ-άουτ Izumo1 και τα θηλυκά ποντίκια νοκ-άουτ Juno είναι εντελώς στείρα, σε αυτά τα μοντέλα το σπέρμα εισέρχεται στον περιβιτελικό χώρο αλλά οι γαμέτες δεν συγχωνεύονται.Ομοίως, η συρροή μειώθηκε όταν οι γαμετές υποβλήθηκαν σε αγωγή με αντισώματα αντι-IZUMO1 ή JUNO27,29 σε πειράματα γονιμοποίησης ανθρώπου in vitro.
Πρόσφατα, ανακαλύφθηκε μια πρόσφατα ανακαλυφθείσα ομάδα πρωτεϊνών που εκφράζονται στο σπέρμα φαινοτυπικά παρόμοια με τις IZUMO1 και JUNO20,30,31,32,33,34,35.Η πρωτεΐνη 6 που σχετίζεται με την ακροσωμική μεμβράνη του σπέρματος (SPACA6) έχει αναγνωριστεί ως απαραίτητη για τη γονιμοποίηση σε μια μεγάλης κλίμακας μελέτη μεταλλαξιογένεσης ποντικών.Η εισαγωγή του διαγονιδίου στο γονίδιο Spaca6 παράγει μη εύτηκτα σπερματοζωάρια, αν και αυτά τα σπερματοζωάρια διεισδύουν στον περιβιλλικό χώρο 36 .Μεταγενέστερες μελέτες νοκ-άουτ σε ποντίκια επιβεβαίωσαν ότι το Spaca6 απαιτείται για τη σύντηξη γαμετών 30,32.Το SPACA6 εκφράζεται σχεδόν αποκλειστικά στους όρχεις και έχει ένα μοτίβο εντοπισμού παρόμοιο με αυτό του IZUMO1, δηλαδή εντός του έσω χιτώνα των σπερματοζωαρίων πριν από την ακροσωμική αντίδραση, και στη συνέχεια μεταναστεύει στην περιοχή του ισημερινού μετά την ακροσωμική αντίδραση 30,32.Ομόλογα Spaca6 υπάρχουν σε μια ποικιλία θηλαστικών και άλλων ευκαρυωτών 30 και η σημασία του για τη σύντηξη ανθρώπινων γαμετών έχει αποδειχθεί με την αναστολή της ανθρώπινης γονιμοποίησης in vitro με αντίσταση στο SPACA6 30 .Σε αντίθεση με τα IZUMO1 και JUNO, οι λεπτομέρειες της δομής, των αλληλεπιδράσεων και της λειτουργίας του SPACA6 παραμένουν ασαφείς.
Για να κατανοήσουμε καλύτερα τη θεμελιώδη διαδικασία στην οποία βασίζεται η σύντηξη ανθρώπινου σπέρματος και ωαρίων, η οποία θα μας επιτρέψει να ενημερώσουμε τις μελλοντικές εξελίξεις στον οικογενειακό προγραμματισμό και τη θεραπεία γονιμότητας, πραγματοποιήσαμε δομικές και βιοχημικές μελέτες SPACA6.Η κρυσταλλική δομή της εξωκυτταρικής περιοχής του SPACA6 δείχνει μια τετραέλικτη δέσμη (4ΗΒ) και μια περιοχή παρόμοια με ανοσοσφαιρίνη (όμοια με Ig) που συνδέονται με οιονεί εύκαμπτες περιοχές.Όπως είχε προβλεφθεί σε προηγούμενες μελέτες, 7,32,37 η δομή της περιοχής του SPACA6 είναι παρόμοια με αυτή του ανθρώπινου IZUMO1 και οι δύο πρωτεΐνες μοιράζονται ένα ασυνήθιστο μοτίβο: 4HB με τριγωνική ελικοειδή επιφάνεια και ένα ζεύγος μοτίβων CXXC που συνδέονται με δισουλφίδιο.Προτείνουμε ότι τα IZUMO1 και SPACA6 ορίζουν τώρα μια μεγαλύτερη, δομικά σχετική υπεροικογένεια πρωτεϊνών που σχετίζονται με τη σύντηξη γαμετών.Χρησιμοποιώντας χαρακτηριστικά μοναδικά για την υπεροικογένεια, πραγματοποιήσαμε μια εξαντλητική έρευνα για το δομικό ανθρώπινο πρωτεώμα AlphaFold, εντοπίζοντας επιπλέον μέλη αυτής της υπεροικογένειας, συμπεριλαμβανομένων πολλών μελών που εμπλέκονται στη σύντηξη γαμετών και/ή στη γονιμοποίηση.Φαίνεται τώρα ότι υπάρχει μια κοινή δομική πτυχή και υπεροικογένεια πρωτεϊνών που σχετίζονται με τη σύντηξη γαμετών και η δομή μας παρέχει έναν μοριακό χάρτη αυτής της σημαντικής πτυχής του μηχανισμού σύντηξης ανθρώπινου γαμετών.
Η SPACA6 είναι μια διαμεμβρανική πρωτεΐνη μονής διέλευσης με μία Ν-συνδεδεμένη γλυκάνη και έξι υποτιθέμενους δισουλφιδικούς δεσμούς (Εικόνες S1a και S2).Εκφράσαμε την εξωκυτταρική περιοχή του ανθρώπινου SPACA6 (υπολείμματα 27-246) σε κύτταρα Drosophila S2 και καθαρίσαμε την πρωτεΐνη χρησιμοποιώντας χρωματογραφία συγγένειας νικελίου, ανταλλαγής κατιόντων και χρωματογραφία αποκλεισμού μεγέθους (Εικ. S1b).Η καθαρισμένη εξωτομή SPACA6 είναι πολύ σταθερή και ομοιογενής.Η ανάλυση με χρήση χρωματογραφίας αποκλεισμού μεγέθους σε συνδυασμό με πολυγωνική σκέδαση φωτός (SEC-MALS) αποκάλυψε μία κορυφή με υπολογισμένο μοριακό βάρος 26,2 ± 0,5 kDa (Σχήμα S1c).Αυτό είναι σύμφωνο με το μέγεθος του μονομερούς εξωτομέα SPACA6, υποδεικνύοντας ότι ο ολιγομερισμός δεν έλαβε χώρα κατά τη διάρκεια του καθαρισμού.Επιπλέον, η φασματοσκοπία κυκλικού διχρωμισμού (CD) αποκάλυψε μια μικτή δομή α/β με σημείο τήξης 51,3 °C (Εικ. S1d,e).Η αποσυνέλιξη των φασμάτων CD αποκάλυψε 38,6% α-έλικα και 15,8% β-κλώνα στοιχεία (Εικόνα S1d).
Η εξωτομή SPACA6 κρυσταλλώθηκε χρησιμοποιώντας τυχαία σπορά μήτρας38 με αποτέλεσμα ένα σύνολο δεδομένων με ανάλυση 2,2 Α (Πίνακας 1 και Εικόνα S3).Χρησιμοποιώντας έναν συνδυασμό δεδομένων μοριακής υποκατάστασης που βασίζονται σε θραύσματα και δεδομένων φάσης SAD με έκθεση σε βρωμίδιο για τον προσδιορισμό της δομής (Πίνακας 1 και Εικόνα S4), το τελικό εξευγενισμένο μοντέλο αποτελείται από υπολείμματα 27-246.Τη στιγμή που προσδιορίστηκε η δομή, δεν υπήρχαν διαθέσιμες πειραματικές ή AlphaFold δομές.Ο εξωτομέας SPACA6 έχει διαστάσεις 20 Å × 20 Å × 85 Å, αποτελείται από επτά έλικες και εννέα β-κλώνους και έχει μια επιμήκη τριτογενή πτυχή που σταθεροποιείται από έξι δισουλφιδικούς δεσμούς (Εικ. 1a, b).Η ασθενής πυκνότητα ηλεκτρονίων στο τέλος της πλευρικής αλυσίδας Asn243 δείχνει ότι αυτό το υπόλειμμα είναι μια Ν-συνδεδεμένη γλυκοζυλίωση.Η δομή αποτελείται από δύο τομείς: μια Ν-τερματική δέσμη τεσσάρων έλικας (4HB) και μια C-τερματική περιοχή παρόμοια με Ig με μια ενδιάμεση περιοχή άρθρωσης μεταξύ τους (Εικ. 1c).
μια Δομή της εξωκυτταρικής περιοχής του SPACA6.Διάγραμμα λωρίδας της εξωκυτταρικής περιοχής του SPACA6, το χρώμα της αλυσίδας από το Ν έως το C-άκρο από σκούρο μπλε έως σκούρο κόκκινο.Οι κυστεΐνες που εμπλέκονται στους δισουλφιδικούς δεσμούς επισημαίνονται στο ματζέντα.β Τοπολογία της εξωκυτταρικής περιοχής του SPACA6.Χρησιμοποιήστε τον ίδιο συνδυασμό χρωμάτων όπως στο Σχήμα 1α.c SPACA6 εξωκυτταρική περιοχή.Τα γραφήματα λωρίδων τομέα 4HB, μεντεσέδων και Ig είναι χρωματισμένα σε πορτοκαλί, πράσινο και μπλε, αντίστοιχα.Τα επίπεδα δεν σχεδιάζονται σε κλίμακα.
Η περιοχή 4HB του SPACA6 περιλαμβάνει τέσσερις κύριες έλικες (έλικες 1-4), οι οποίες είναι διατεταγμένες με τη μορφή ελικοειδούς έλικας (Εικ. 2α), που εναλλάσσονται μεταξύ αντιπαράλληλων και παράλληλων αλληλεπιδράσεων (Εικ. 2β).Μια μικρή πρόσθετη έλικα μονής στροφής (έλικα 1′) τοποθετείται κάθετα στη δέσμη, σχηματίζοντας ένα τρίγωνο με τις έλικες 1 και 2. Αυτό το τρίγωνο παραμορφώνεται ελαφρά στην ελικοειδώς στριμμένη συσκευασία της σχετικά πυκνής συσκευασίας των ελίκων 3 και 4 ( Εικ. 2α).
4HB Ν-τερματικό διάγραμμα ταινίας.β Κάτοψη μιας δέσμης τεσσάρων ελίκων, με κάθε έλικα τονισμένη με σκούρο μπλε στο Β-άκρο και σκούρο κόκκινο στο C-άκρο.c Διάγραμμα σπειροειδούς τροχού από πάνω προς τα κάτω για 4HB, με κάθε υπόλειμμα να εμφανίζεται ως κύκλος με έναν κωδικό αμινοξέος ενός γράμματος.μόνο τα τέσσερα αμινοξέα στην κορυφή του τροχού είναι αριθμημένα.Τα μη πολικά υπολείμματα χρωματίζονται με κίτρινο χρώμα, τα πολικά αφόρτιστα υπολείμματα έχουν πράσινο χρώμα, τα θετικά φορτισμένα υπολείμματα έχουν μπλε χρώμα και τα αρνητικά φορτισμένα υπολείμματα έχουν κόκκινο χρώμα.d Τριγωνικές όψεις του τομέα 4HB, με 4HB σε πορτοκαλί και μεντεσέδες σε πράσινο.Και τα δύο ένθετα δείχνουν δισουλφιδικούς δεσμούς σε σχήμα ράβδου.
Το 4HB συγκεντρώνεται σε έναν εσωτερικό υδρόφοβο πυρήνα που αποτελείται κυρίως από αλειφατικά και αρωματικά υπολείμματα (Εικ. 2γ).Ο πυρήνας περιέχει έναν δισουλφιδικό δεσμό μεταξύ Cys41 και Cys55 που συνδέει τις έλικες 1 και 2 μεταξύ τους σε ένα πάνω ανυψωμένο τρίγωνο (Εικ. 2δ).Δύο επιπλέον δισουλφιδικοί δεσμοί σχηματίστηκαν μεταξύ του μοτίβου CXXC στην Helix 1' και ενός άλλου μοτίβου CXXC που βρέθηκε στην άκρη της β-φουρκέτας στην περιοχή της άρθρωσης (Εικ. 2δ).Ένα συντηρητικό υπόλειμμα αργινίνης με άγνωστη λειτουργία (Arg37) βρίσκεται μέσα σε ένα κοίλο τρίγωνο που σχηματίζεται από έλικες 1', 1 και 2. Τα αλειφατικά άτομα άνθρακα Cβ, Cγ και Cδ Arg37 αλληλεπιδρούν με τον υδρόφοβο πυρήνα και οι ομάδες γουανιδίνης του κινούνται κυκλικά μεταξύ των ελίκων 1' και 1 μέσω αλληλεπιδράσεων μεταξύ της ραχοκοκαλιάς Thr32 και της πλευρικής αλυσίδας (Εικ. S5a,b).Το Tyr34 εκτείνεται μέσα στην κοιλότητα αφήνοντας δύο μικρές κοιλότητες μέσω των οποίων το Arg37 μπορεί να αλληλεπιδράσει με τον διαλύτη.
Οι περιοχές β-σάντουιτς τύπου Ig είναι μια μεγάλη υπεροικογένεια πρωτεϊνών που μοιράζονται το κοινό χαρακτηριστικό δύο ή περισσότερων πολυκλωνικών αμφιπαθικών β-φύλλων που αλληλεπιδρούν μέσω ενός υδρόφοβου πυρήνα 39. Η C-τερματική περιοχή παρόμοια με Ig του SPACA6 έχει το ίδιο μοτίβο και αποτελείται από δύο στρώσεις (Εικ. S6a).Το φύλλο 1 είναι ένα β-φύλλο τεσσάρων κλώνων (κλώνοι D, F, H και I) όπου οι κλώνοι F, H και I σχηματίζουν μια αντιπαράλληλη διάταξη και οι κλώνοι I και D λαμβάνουν παράλληλη αλληλεπίδραση.Ο Πίνακας 2 είναι ένα μικρό αντιπαράλληλο δίκλωνο φύλλο βήτα (κλώνοι Ε και G).Παρατηρήθηκε ένας εσωτερικός δισουλφιδικός δεσμός μεταξύ του C-άκρου της αλυσίδας Ε και του κέντρου της αλυσίδας Η (Cys170-Cys226) (Εικ. S6b).Αυτός ο δισουλφιδικός δεσμός είναι ανάλογος με τον δισουλφιδικό δεσμό στην περιοχή β-σάντουιτς της ανοσοσφαιρίνης40,41.
Το τετράκλωνο φύλλο β περιστρέφεται σε όλο το μήκος του, σχηματίζοντας ασύμμετρες ακμές που διαφέρουν σε σχήμα και ηλεκτροστατικότητα.Το λεπτότερο άκρο είναι μια επίπεδη υδρόφοβη περιβαλλοντική επιφάνεια που ξεχωρίζει σε σύγκριση με τις υπόλοιπες ανώμαλες και ηλεκτροστατικά διαφορετικές επιφάνειες στο SPACA6 (Εικ. S6b,c).Ένα φωτοστέφανο από εκτεθειμένες ραχοκοκαλιές καρβονυλ/αμινο ομάδες και πολικές πλευρικές αλυσίδες περιβάλλει την υδρόφοβη επιφάνεια (Εικ. S6c).Το ευρύτερο περιθώριο καλύπτεται από ένα καλυμμένο ελικοειδή τμήμα που μπλοκάρει το Ν-τερματικό τμήμα του υδρόφοβου πυρήνα και σχηματίζει τρεις δεσμούς υδρογόνου με την ανοιχτή πολική ομάδα της ραχοκοκαλιάς της αλυσίδας F (Εικ. S6d).Το C-τερματικό τμήμα αυτής της ακμής σχηματίζει μια μεγάλη τσέπη με έναν μερικώς εκτεθειμένο υδρόφοβο πυρήνα.Ο θύλακας περιβάλλεται από θετικά φορτία λόγω τριών σετ υπολειμμάτων διπλής αργινίνης (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 και Arg212-Arg214) και μιας κεντρικής ιστιδίνης (His220) (Εικόνα S6e).
Η περιοχή άρθρωσης είναι ένα μικρό τμήμα μεταξύ της ελικοειδούς περιοχής και της περιοχής που μοιάζει με Ig, που αποτελείται από ένα αντιπαράλληλο τρίκλωνο β-στρώμα (κλώνοι Α, Β και C), μια μικρή έλικα 310 και πολλά μακρά τυχαία ελικοειδή τμήματα.(Εικ. S7).Ένα δίκτυο ομοιοπολικών και ηλεκτροστατικών επαφών στην περιοχή της άρθρωσης φαίνεται να σταθεροποιεί τον προσανατολισμό μεταξύ του 4HB και της περιοχής που μοιάζει με Ig.Το δίκτυο μπορεί να χωριστεί σε τρία μέρη.Το πρώτο μέρος περιλαμβάνει δύο μοτίβα CXXC (27CXXC30 και 139CXXC142) που σχηματίζουν ένα ζεύγος δισουλφιδικών δεσμών μεταξύ της β-φουρκέτας στον μεντεσέ και της έλικας 1' στο 4HB.Το δεύτερο μέρος περιλαμβάνει ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ της περιοχής που μοιάζει με Ig και της άρθρωσης.Το Glu132 στην άρθρωση σχηματίζει μια γέφυρα αλατιού με το Arg233 στην περιοχή που μοιάζει με Ig και το Arg135 στην άρθρωση.Το τρίτο μέρος περιλαμβάνει έναν ομοιοπολικό δεσμό μεταξύ της περιοχής που μοιάζει με Ig και της περιοχής άρθρωσης.Δύο δισουλφιδικοί δεσμοί (Cys124-Cys147 και Cys128-Cys153) συνδέουν τον βρόχο άρθρωσης σε έναν συνδετήρα που σταθεροποιείται από ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ του Gln131 και της λειτουργικής ομάδας κορμού, επιτρέποντας την πρόσβαση στην πρώτη περιοχή παρόμοια με Ig.αλυσίδα.
Η δομή του εξωτομέα SPACA6 και οι μεμονωμένες δομές τομέων 4HB και παρόμοιων με Ig χρησιμοποιήθηκαν για την αναζήτηση δομικά παρόμοιων εγγραφών σε βάσεις δεδομένων πρωτεϊνών 42 .Εντοπίσαμε αγώνες με υψηλές βαθμολογίες Dali Z, μικρές τυπικές αποκλίσεις και μεγάλες βαθμολογίες LALI (το τελευταίο είναι ο αριθμός των δομικά ισοδύναμων υπολειμμάτων).Ενώ οι πρώτες 10 επισκέψεις από την πλήρη αναζήτηση ectodomain (Πίνακας S1) είχαν αποδεκτό Z-score >842, μια αναζήτηση μόνο για τομέα 4HB ή παρόμοιο με Ig έδειξε ότι οι περισσότερες από αυτές τις επισκέψεις αντιστοιχούσαν μόνο σε β-σάντουιτς.μια πανταχού παρούσα πτυχή που βρίσκεται σε πολλές πρωτεΐνες.Και οι τρεις αναζητήσεις στο Dali επέστρεψαν μόνο ένα αποτέλεσμα: IZUMO1.
Έχει προταθεί εδώ και καιρό ότι το SPACA6 και το IZUMO1 μοιράζονται δομικές ομοιότητες7,32,37.Αν και οι εξωτομείς αυτών των δύο πρωτεϊνών που σχετίζονται με τη σύντηξη γαμετών μοιράζονται μόνο 21% ταυτότητα αλληλουχίας (Εικόνα S8a), πολύπλοκα στοιχεία, συμπεριλαμβανομένου ενός διατηρημένου μοτίβου δισουλφιδικού δεσμού και μιας προβλεπόμενης C-τερματικής περιοχής που μοιάζει με Ig στο SPACA6, επέτρεψαν πρώιμες προσπάθειες για τη δημιουργία ενός μοντέλο ομολογίας ποντικιού A και SPACA6 χρησιμοποιώντας το IZUMO1 ως πρότυπο37.Η δομή μας επιβεβαιώνει αυτές τις προβλέψεις και δείχνει τον πραγματικό βαθμό ομοιότητας.Στην πραγματικότητα, οι δομές SPACA6 και IZUMO137,43,44 μοιράζονται την ίδια αρχιτεκτονική δύο τομέων (Εικ. S8b) με παρόμοιες περιοχές β-σάντουιτς 4HB και τύπου Ig που συνδέονται με μια περιοχή άρθρωσης (Εικ. S8c).
Τα IZUMO1 και SPACA6 4HB έχουν κοινές διαφορές από τα συμβατικά σπειροειδή πακέτα.Τα τυπικά 4HBs, όπως αυτά που βρέθηκαν στα συμπλέγματα πρωτεϊνών SNARE που εμπλέκονται στην ενδοσωμική σύντηξη 45,46, έχουν ομοιόμορφες έλικες που διατηρούν σταθερή καμπυλότητα γύρω από έναν κεντρικό άξονα 47. Αντίθετα, οι ελικοειδείς περιοχές τόσο στο IZUMO1 όσο και στο SPACA6 παραμορφώθηκαν, με μεταβλητή καμπυλότητα και ανομοιόμορφη συσκευασία (Εικόνα S8d).Η συστροφή, που πιθανώς προκαλείται από το τρίγωνο που σχηματίζεται από τις έλικες 1', 1 και 2, διατηρείται στο IZUMO1 και στο SPACA6 και σταθεροποιείται από το ίδιο μοτίβο CXXC στην έλικα 1'.Ωστόσο, ο πρόσθετος δισουλφιδικός δεσμός που βρίσκεται στο SPACA6 (Cys41 και Cys55 που συνδέουν ομοιοπολικά έλικες 1 και 2 παραπάνω) δημιουργεί μια πιο έντονη κορυφή στην κορυφή του τριγώνου, καθιστώντας το SPACA6 πιο στριμμένο από το IZUMO1, με πιο έντονα τρίγωνα κοιλότητας.Επιπλέον, το IZUMO1 στερείται Arg37 που παρατηρείται στο κέντρο αυτής της κοιλότητας στο SPACA6.Αντίθετα, το IZUMO1 έχει έναν πιο τυπικό υδρόφοβο πυρήνα αλειφατικών και αρωματικών υπολειμμάτων.
Το IZUMO1 έχει μια περιοχή παρόμοια με Ig που αποτελείται από ένα δίκλωνο και πεντάκλωνο β-φύλλο43.Ο επιπλέον κλώνος στο IZUMO1 αντικαθιστά το πηνίο στο SPACA6, το οποίο αλληλεπιδρά με τον κλώνο F για να περιορίσει τους δεσμούς υδρογόνου του κορμού στον κλώνο.Ένα ενδιαφέρον σημείο σύγκρισης είναι το προβλεπόμενο επιφανειακό φορτίο των περιοχών που μοιάζουν με Ig των δύο πρωτεϊνών.Η επιφάνεια IZUMO1 είναι πιο αρνητικά φορτισμένη από την επιφάνεια SPACA6.Μια πρόσθετη χρέωση βρίσκεται κοντά στο C-άκρο που βλέπει στη μεμβράνη του σπέρματος.Στο SPACA6, οι ίδιες περιοχές ήταν πιο ουδέτερες ή θετικά φορτισμένες (Εικ. S8e).Για παράδειγμα, η υδρόφοβη επιφάνεια (λεπτότερες άκρες) και τα θετικά φορτισμένα κοιλώματα (πλατύτερα άκρα) στο SPACA6 είναι αρνητικά φορτισμένα στο IZUMO1.
Αν και η σχέση και τα δευτερεύοντα στοιχεία δομής μεταξύ IZUMO1 και SPACA6 διατηρούνται καλά, η δομική ευθυγράμμιση των περιοχών που μοιάζουν με Ig έδειξε ότι οι δύο περιοχές διαφέρουν ως προς τον γενικό προσανατολισμό τους μεταξύ τους (Εικ. S9).Η σπειροειδής δέσμη του IZUMO1 είναι κυρτή γύρω από το β-σάντουιτς, δημιουργώντας το σχήμα «μπούμερανγκ» που περιγράφηκε προηγουμένως σε περίπου 50° από τον κεντρικό άξονα.Αντίθετα, η ελικοειδής δέσμη στο SPACA6 είχε κλίση περίπου 10° προς την αντίθετη κατεύθυνση.Οι διαφορές σε αυτούς τους προσανατολισμούς είναι πιθανό να οφείλονται σε διαφορές στην περιοχή της άρθρωσης.Στο επίπεδο της πρωτογενούς αλληλουχίας, το IZUMO1 και το SPACA6 μοιράζονται μικρή ομοιότητα αλληλουχίας στην άρθρωση, με εξαίρεση τα υπολείμματα κυστεΐνης, γλυκίνης και ασπαρτικού οξέος.Ως αποτέλεσμα, οι δεσμοί υδρογόνου και τα ηλεκτροστατικά δίκτυα είναι εντελώς διαφορετικά.Τα δευτερεύοντα δομικά στοιχεία β-φύλλων μοιράζονται τα IZUMO1 και SPACA6, αν και οι αλυσίδες στο IZUMO1 είναι πολύ μεγαλύτερες και η έλικα 310 (έλικα 5) είναι μοναδική για το SPACA6.Αυτές οι διαφορές έχουν ως αποτέλεσμα διαφορετικούς προσανατολισμούς περιοχών για δύο κατά τα άλλα παρόμοιες πρωτεΐνες.
Η αναζήτησή μας στον διακομιστή Dali αποκάλυψε ότι το SPACA6 και το IZUMO1 είναι οι μόνες δύο πειραματικά προσδιορισμένες δομές που είναι αποθηκευμένες στη βάση δεδομένων πρωτεϊνών που έχουν αυτή τη συγκεκριμένη πτυχή 4HB (Πίνακας S1).Πιο πρόσφατα, η DeepMind (Alphabet/Google) ανέπτυξε το AlphaFold, ένα σύστημα βασισμένο σε νευρωνικό δίκτυο που μπορεί να προβλέψει με ακρίβεια τις τρισδιάστατες δομές των πρωτεϊνών από τις πρωτεύουσες αλληλουχίες48.Λίγο αφότου λύσαμε τη δομή SPACA6, κυκλοφόρησε η βάση δεδομένων AlphaFold, παρέχοντας μοντέλα πρόβλεψης δομής που καλύπτουν το 98,5% όλων των πρωτεϊνών στο ανθρώπινο πρωτεϊνικό σώμα48,49.Χρησιμοποιώντας την επιλυμένη δομή SPACA6 ως μοντέλο αναζήτησης, μια αναζήτηση δομικής ομολογίας για το μοντέλο στο ανθρώπινο πρωτεόμιο AlphaFold εντόπισε υποψήφιους με πιθανές δομικές ομοιότητες με το SPACA6 και το IZUMO1.Δεδομένης της απίστευτης ακρίβειας του AlphaFold στην πρόβλεψη του SPACA6 (Εικ. S10a)—ειδικά του εξωτομέα 1,1 Å rms σε σύγκριση με την επιλυμένη δομή μας (Εικ. S10b)— μπορούμε να είμαστε βέβαιοι ότι οι ταυτοποιημένες αντιστοιχίσεις SPACA6 είναι πιθανό να είναι ακριβείς.
Προηγουμένως, το PSI-BLAST αναζήτησε το σύμπλεγμα IZUMO1 με τρεις άλλες πρωτεΐνες που σχετίζονται με το σπέρμα: IZUMO2, IZUMO3 και IZUMO450.Το AlphaFold προέβλεψε ότι αυτές οι πρωτεΐνες της οικογένειας IZUMO διπλώνουν στην περιοχή 4HB με το ίδιο μοτίβο δισουλφιδικού δεσμού με το IZUMO1 (Εικόνες 3a και S11), αν και δεν έχουν περιοχή παρόμοια με Ig.Υποτίθεται ότι το IZUMO2 και το IZUMO3 είναι μονόπλευρες μεμβρανικές πρωτεΐνες παρόμοιες με το IZUMO1, ενώ το IZUMO4 φαίνεται να εκκρίνεται.Οι λειτουργίες των πρωτεϊνών IZUMO 2, 3 και 4 στη σύντηξη γαμετών δεν έχουν προσδιοριστεί.Το IZUMO3 είναι γνωστό ότι παίζει ρόλο στη βιογένεση των ακροσωμάτων κατά την ανάπτυξη των σπερματοζωαρίων51 και η πρωτεΐνη IZUMO σχηματίζει ένα σύμπλεγμα50.Η διατήρηση των πρωτεϊνών IZUMO σε θηλαστικά, ερπετά και αμφίβια υποδηλώνει ότι η πιθανή λειτουργία τους είναι σύμφωνη με αυτή άλλων γνωστών πρωτεϊνών που σχετίζονται με τη σύντηξη γαμετών, όπως οι DCST1/2, SOF1 και FIMP.
Διάγραμμα της αρχιτεκτονικής τομέα της υπεροικογένειας IST, με τομείς 4HB, άρθρωσης και τύπου Ig τονισμένους με πορτοκαλί, πράσινο και μπλε, αντίστοιχα.Το IZUMO4 έχει μια μοναδική περιοχή C-τερματικού που φαίνεται μαύρη.Οι επιβεβαιωμένοι και οι υποτιθέμενοι δισουλφιδικοί δεσμοί φαίνονται με συμπαγείς και διακεκομμένες γραμμές, αντίστοιχα.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1) και DB: AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) εμφανίζονται στην ίδια χρωματική περιοχή με το πλαίσιο Α. Οι δισουλφιδικοί δεσμοί εμφανίζονται με ματζέντα.Οι διαμεμβρανικές έλικες TMEM95, IZUMO2 και IZUMO3 δεν εμφανίζονται.
Σε αντίθεση με την πρωτεΐνη IZUMO, άλλες πρωτεΐνες SPACA (δηλαδή SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5 και SPACA9) πιστεύεται ότι είναι δομικά διαφορετικές από τις SPACA6 (Εικ. S12).Μόνο το SPACA9 έχει 4HB, αλλά δεν αναμένεται να έχει τον ίδιο παράλληλο-αντιπαράλληλο προσανατολισμό ή τον ίδιο δισουλφιδικό δεσμό με το SPACA6.Μόνο το SPACA1 έχει παρόμοιο τομέα που μοιάζει με Ig.Το AlphaFold προβλέπει ότι τα SPACA3, SPACA4 και SPACA5 έχουν εντελώς διαφορετική δομή από το SPACA6.Είναι ενδιαφέρον ότι το SPACA4 είναι επίσης γνωστό ότι παίζει ρόλο στη γονιμοποίηση, αλλά σε μεγαλύτερο βαθμό από το SPACA6, διευκολύνοντας αντ' αυτού την αλληλεπίδραση μεταξύ του σπέρματος και της διαφανούς ζώνης ωοκυττάρου52.
Η αναζήτησή μας στο AlphaFold βρήκε άλλη αντιστοιχία για τα IZUMO1 και SPACA6 4HB, TMEM95.Το TMEM95, μια μοναδική διαμεμβρανική πρωτεΐνη ειδική για το σπέρμα, καθιστά τα αρσενικά ποντίκια στείρα όταν αφαιρεθούν 32,33.Τα σπερματοζωάρια που δεν είχαν TMEM95 είχαν φυσιολογική μορφολογία, κινητικότητα και την ικανότητα να διεισδύουν στη διαφανή ζώνη και να συνδέονται με τη μεμβράνη του ωαρίου, αλλά δεν μπορούσαν να συντηχθούν με τη μεμβράνη του ωαρίου.Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι το TMEM95 έχει δομικές ομοιότητες με το IZUMO133.Πράγματι, το μοντέλο AlphaFold επιβεβαίωσε ότι το TMEM95 είναι ένα 4HB με το ίδιο ζεύγος μοτίβων CXXC με τα IZUMO1 και SPACA6 και τον ίδιο πρόσθετο δισουλφιδικό δεσμό μεταξύ των ελίκων 1 και 2 που βρίσκονται στο SPACA6 (Εικ. 3a και S11).Αν και το TMEM95 στερείται περιοχής που μοιάζει με Ig, έχει μια περιοχή με μοτίβο δισουλφιδικού δεσμού παρόμοιο με τις περιοχές άρθρωσης SPACA6 και IZUMO1 (Εικ. 3β).Κατά τη δημοσίευση αυτού του χειρογράφου, ο διακομιστής προεκτύπωσης ανέφερε τη δομή του TMEM95, επιβεβαιώνοντας το αποτέλεσμα AlphaFold53.Το TMEM95 είναι πολύ παρόμοιο με το SPACA6 και το IZUMO1 και διατηρείται εξελικτικά ήδη στα αμφίβια (Εικ. 4 και S13).
Η αναζήτηση PSI-BLAST χρησιμοποίησε τις βάσεις δεδομένων NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP και SOF1 για να καθορίσει τη θέση αυτών των ακολουθιών στο δέντρο της ζωής.Οι αποστάσεις μεταξύ των σημείων διακλάδωσης δεν εμφανίζονται σε κλίμακα.
Η εντυπωσιακή συνολική δομική ομοιότητα μεταξύ SPACA6 και IZUMO1 υποδηλώνει ότι είναι ιδρυτικά μέλη μιας διατηρημένης δομικής υπεροικογένειας που περιλαμβάνει τις πρωτεΐνες TMEM95 και IZUMO 2, 3 και 4.γνωστά μέλη: IZUMO1, SPACA6 και TMEM95.Επειδή μόνο λίγα μέλη διαθέτουν περιοχές τύπου Ig, το σήμα κατατεθέν της υπεροικογένειας IST είναι ο τομέας 4HB, ο οποίος έχει μοναδικά χαρακτηριστικά κοινά σε όλες αυτές τις πρωτεΐνες: 1) Σπειρωμένο 4HB με έλικες διατεταγμένες σε αντιπαράλληλη/παράλληλη εναλλαγή (Εικ. 5α), 2) η δέσμη έχει μια τριγωνική όψη που αποτελείται από δύο έλικες μέσα στη δέσμη και μια τρίτη κάθετη έλικα (Εικ. περιοχή κλειδιού (Εικ. 5γ). Το μοτίβο CXXC, που βρίσκεται σε πρωτεΐνες που μοιάζουν με θειορεδοξίνη, είναι γνωστό ότι λειτουργεί ως αισθητήρας οξειδοαναγωγής 54,55,56, ενώ το μοτίβο στα μέλη της οικογένειας IST μπορεί να συσχετιστεί με πρωτεϊνικές δισουλφιδικές ισομεράσες όπως η ERp57 στη σύντηξη γαμετών.Οι ρόλοι συνδέονται 57,58.
Τα μέλη της υπεροικογένειας IST ορίζονται από τρία χαρακτηριστικά γνωρίσματα του τομέα 4HB: τέσσερις έλικες που εναλλάσσονται μεταξύ παράλληλου και αντιπαράλληλου προσανατολισμού, τριγωνικές ελικοειδείς όψεις δέσμης και ένα διπλό μοτίβο περίπου CXXC που σχηματίζεται μεταξύ μικρών μορίων.) Ν-τελικές έλικες (πορτοκαλί) και περιοχή άρθρωσης β-φουρκέτα (πράσινη).
Δεδομένης της ομοιότητας μεταξύ του SPACA6 και του IZUMO1, δοκιμάστηκε η ικανότητα του πρώτου να συνδέεται με το IZUMO1 ή το JUNO.Η συμβολομετρία βιοστιβάδων (BLI) είναι μια μέθοδος δέσμευσης με βάση την κινητική που έχει χρησιμοποιηθεί στο παρελθόν για την ποσοτικοποίηση της αλληλεπίδρασης μεταξύ IZUMO1 και JUNO.Μετά την επώαση του σημασμένου με βιοτίνη αισθητήρα με IZUMO1 ως δόλωμα με υψηλή συγκέντρωση αναλυόμενης ουσίας JUNO, ανιχνεύθηκε ένα ισχυρό σήμα (Εικ. S14a), υποδεικνύοντας μια αλλαγή που προκαλείται από τη δέσμευση στο πάχος του βιοϋλικού που συνδέεται στο άκρο του αισθητήρα.Παρόμοια σήματα (δηλαδή, το JUNO συνδέεται με τον αισθητήρα ως δόλωμα κατά του αναλύτη IZUMO1) (Εικ. S14b).Δεν ανιχνεύθηκε σήμα όταν το SPACA6 χρησιμοποιήθηκε ως αναλύτης έναντι του δεσμευμένου με αισθητήρα IZUMO1 ή του JUNO που συνδέεται με τον αισθητήρα (Εικόνα S14a,b).Η απουσία αυτού του σήματος δείχνει ότι η εξωκυτταρική περιοχή του SPACA6 δεν αλληλεπιδρά με την εξωκυτταρική περιοχή του IZUMO1 ή του JUNO.
Επειδή ο προσδιορισμός BLI βασίζεται στη βιοτινυλίωση των ελεύθερων υπολειμμάτων λυσίνης στην πρωτεΐνη δολώματος, αυτή η τροποποίηση μπορεί να αποτρέψει τη δέσμευση εάν στην αλληλεπίδραση εμπλέκονται υπολείμματα λυσίνης.Επιπλέον, ο προσανατολισμός της δέσμευσης σε σχέση με τον αισθητήρα μπορεί να δημιουργήσει στερικά εμπόδια, επομένως πραγματοποιήθηκαν επίσης συμβατικές αναλύσεις pull-down στις ανασυνδυασμένες εξωτομείς SPACA6, IZUMO1 και JUNO.Παρόλα αυτά, το SPACA6 δεν κατακρημνίστηκε με IZUMO1 με επισήμανση His ή JUNO με επισήμανση His (Εικ. S14c,d), υποδεικνύοντας ότι δεν υπάρχει αλληλεπίδραση σύμφωνη με αυτή που παρατηρήθηκε στα πειράματα BLI.Ως θετικός έλεγχος, επιβεβαιώσαμε την αλληλεπίδραση του JUNO με το επισημασμένο His IZUMO1 (Εικόνες S14e και S15).
Παρά τη δομική ομοιότητα μεταξύ του SPACA6 και του IZUMO1, η αδυναμία του SPACA6 να δεσμεύσει το JUNO δεν προκαλεί έκπληξη.Η επιφάνεια του ανθρώπινου IZUMO1 έχει περισσότερα από 20 υπολείμματα που αλληλεπιδρούν με το JUNO, συμπεριλαμβανομένων των υπολειμμάτων από καθεμία από τις τρεις περιοχές (αν και τα περισσότερα από αυτά βρίσκονται στην περιοχή της άρθρωσης) (Εικ. S14f).Από αυτά τα υπολείμματα, μόνο ένα διατηρείται στο SPACA6 (Glu70).Ενώ πολλές υποκαταστάσεις υπολειμμάτων διατήρησαν τις αρχικές βιοχημικές τους ιδιότητες, το βασικό υπόλειμμα Arg160 στο IZUMO1 αντικαταστάθηκε από το αρνητικά φορτισμένο Asp148 στο SPACA6.Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η μετάλλαξη Arg160Glu στο IZUMO1 καταργεί σχεδόν πλήρως τη σύνδεση με το JUNO43.Επιπλέον, η διαφορά στον προσανατολισμό της περιοχής μεταξύ IZUMO1 και SPACA6 αύξησε σημαντικά την επιφάνεια της θέσης δέσμευσης JUNO της ισοδύναμης περιοχής στο SPACA6 (Εικ. S14g).
Παρά τη γνωστή ανάγκη για SPACA6 για σύντηξη γαμετών και την ομοιότητά του με το IZUMO1, το SPACA6 δεν φαίνεται να έχει ισοδύναμη λειτουργία δέσμευσης JUNO.Ως εκ τούτου, προσπαθήσαμε να συνδυάσουμε τα δομικά μας δεδομένα με στοιχεία σπουδαιότητας που παρέχονται από την εξελικτική βιολογία.Η ευθυγράμμιση αλληλουχίας των ομολόγων SPACA6 δείχνει τη διατήρηση της κοινής δομής πέρα ​​από τα θηλαστικά.Για παράδειγμα, υπολείμματα κυστεΐνης υπάρχουν ακόμη και σε απομακρυσμένα συγγενικά αμφίβια (Εικ. 6α).Χρησιμοποιώντας τον διακομιστή ConSurf, αντιστοιχίστηκαν δεδομένα διατήρησης πολλαπλής στοίχισης ακολουθιών 66 ακολουθιών στην επιφάνεια SPACA6.Αυτός ο τύπος ανάλυσης μπορεί να δείξει ποια υπολείμματα έχουν διατηρηθεί κατά την εξέλιξη της πρωτεΐνης και μπορεί να υποδείξει ποιες περιοχές επιφάνειας παίζουν ρόλο στη λειτουργία.
μια ευθυγράμμιση αλληλουχίας εξωτομέων SPACA6 από 12 διαφορετικά είδη που παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας CLUSTAL OMEGA.Σύμφωνα με την ανάλυση ConSurf, οι πιο συντηρητικές θέσεις σημειώνονται με μπλε χρώμα.Τα υπολείμματα κυστεΐνης επισημαίνονται με κόκκινο χρώμα.Τα όρια τομέα και τα στοιχεία δευτερεύουσας δομής εμφανίζονται στην κορυφή της ευθυγράμμισης, όπου τα βέλη υποδεικνύουν β-σκέλη και τα κύματα υποδεικνύουν έλικες.Τα αναγνωριστικά πρόσβασης NCBI που περιέχουν τις ακολουθίες είναι: άνθρωπος (Homo sapiens, NP_001303901), μανδρίλιος (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), πίθηκος καπουτσίνος (Cebus mimic, XP_0173593quus_0), XP_0173593quus_0, ίππος (201303901) Orcinus orca3_23 XP_032_034) .), πρόβατο (Ovis aries, XP_014955560), ελέφαντας (Loxodonta africana, XP_010585293), σκύλος (Canis lupus familyis, XP_025277208), ποντίκι (Mus musculus, NP_001156manianph181), , XP_0318), Platypus, 8) , 61_89 και Bullfrog (Bufo bufo, XP_040282113).Η αρίθμηση βασίζεται στην ανθρώπινη τάξη.β Αναπαράσταση επιφάνειας της δομής SPACA6 με 4HB στην κορυφή και τομέα τύπου Ig στο κάτω μέρος, χρώματα που βασίζονται σε εκτιμήσεις διατήρησης από τον διακομιστή ConSurf.Τα καλύτερα διατηρημένα μέρη είναι μπλε, τα μέτρια διατηρημένα μέρη είναι σε λευκό και τα λιγότερο διατηρημένα είναι σε κίτρινο.μωβ κυστεΐνη.Τρεις επιφάνειες που επιδεικνύουν υψηλό επίπεδο προστασίας φαίνονται στα ένθετα επιθέματα 1, 2 και 3. Ένα καρτούν 4HB εμφανίζεται στο ένθετο επάνω δεξιά (ίδιο χρωματικό σχέδιο).
Η δομή SPACA6 έχει τρεις εξαιρετικά διατηρημένες περιοχές επιφάνειας (Εικ. 6β).Το έμπλαστρο 1 εκτείνεται στο 4HB και στην περιοχή της άρθρωσης και περιέχει δύο διατηρημένες δισουλφιδικές γέφυρες CXXC, ένα δίκτυο άρθρωσης Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 (Εικ. S7) και τρία διατηρημένα εξωτερικά αρωματικά υπολείμματα (Phe31, Tyr73, Phe137).ένα ευρύτερο χείλος της περιοχής που μοιάζει με Ig (Εικ. S6e), η οποία αντιπροσωπεύει πολλά θετικά φορτισμένα υπολείμματα στην επιφάνεια του σπέρματος.Είναι ενδιαφέρον ότι αυτό το έμπλαστρο περιέχει έναν επίτοπο αντισώματος που έχει αποδειχθεί προηγουμένως ότι παρεμβαίνει στη λειτουργία του SPACA6 30.Η περιοχή 3 εκτείνεται στην άρθρωση και τη μία πλευρά της περιοχής που μοιάζει με Ig.αυτή η περιοχή περιέχει διατηρημένες προλίνες (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) και πολικά/φορτισμένα υπολείμματα που βλέπουν προς τα έξω.Παραδόξως, τα περισσότερα από τα υπολείμματα στην επιφάνεια του 4HB είναι εξαιρετικά μεταβλητά (Εικ. 6b), αν και η πτυχή διατηρείται σε όλο το ομόλογο SPACA6 (όπως υποδεικνύεται από τον συντηρητισμό του πυρήνα της υδρόφοβης δέσμης) και πέρα ​​από την υπεροικογένεια IST.
Αν και αυτή είναι η μικρότερη περιοχή στο SPACA6 με τα λιγότερα ανιχνεύσιμα δευτερεύοντα στοιχεία δομής, πολλά υπολείμματα περιοχής άρθρωσης (συμπεριλαμβανομένης της περιοχής 3) διατηρούνται σε μεγάλο βαθμό μεταξύ των ομολόγων SPACA6, γεγονός που μπορεί να υποδεικνύει ότι ο προσανατολισμός της ελικοειδούς δέσμης και του β-σάντουιτς παίζει ρόλο.ως συντηρητικός.Ωστόσο, παρά τους εκτεταμένους δεσμούς υδρογόνου και τα ηλεκτροστατικά δίκτυα στην περιοχή άρθρωσης των SPACA6 και IZUMO1, ενδείξεις εγγενούς ευελιξίας μπορούν να φανούν στην ευθυγράμμιση των πολλαπλών επιτρεπόμενων δομών του IZUMO137,43,44.Η ευθυγράμμιση των επιμέρους τομέων επικαλύπτονταν καλά, αλλά ο προσανατολισμός των περιοχών σε σχέση μεταξύ τους κυμαινόταν από 50° έως 70° από τον κεντρικό άξονα (Εικ. S16).Για την κατανόηση της δυναμικής διαμόρφωσης του SPACA6 σε διάλυμα, πραγματοποιήθηκαν πειράματα SAXS (Εικ. S17a,b).Η εκ των προτέρων ανακατασκευή του εξωτομέα SPACA6 συμμορφώθηκε με μια κρυσταλλική δομή ράβδου (Εικ. S18), αν και η γραφική παράσταση Kratky έδειξε κάποιο βαθμό ευελιξίας (Εικ. S17b).Αυτή η διαμόρφωση έρχεται σε αντίθεση με το IZUMO1, στο οποίο η μη δεσμευμένη πρωτεΐνη παίρνει σχήμα μπούμερανγκ τόσο στο πλέγμα όσο και στο διάλυμα43.
Για να προσδιοριστεί συγκεκριμένα η εύκαμπτη περιοχή, πραγματοποιήθηκε φασματοσκοπία μάζας ανταλλαγής υδρογόνου-δευτερίου (H-DXMS) στο SPACA6 και συγκρίθηκε με δεδομένα που ελήφθησαν προηγουμένως στο IZUMO143 (Εικ. 7a,b).Το SPACA6 είναι σαφώς πιο ευέλικτο από το IZUMO1, όπως φαίνεται από μια υψηλότερη ανταλλαγή δευτερίου σε όλη τη δομή μετά από 100.000 s ανταλλαγής.Και στις δύο δομές, το C-τερματικό τμήμα της περιοχής άρθρωσης παρουσιάζει υψηλό επίπεδο ανταλλαγής, το οποίο πιθανώς επιτρέπει περιορισμένη περιστροφή τομέων 4HB και Ig σε σχέση μεταξύ τους.Είναι ενδιαφέρον ότι το C-τερματικό τμήμα της άρθρωσης SPACA6, που αποτελείται από το υπόλειμμα 147CDLPLDCP154, είναι μια εξαιρετικά διατηρημένη περιοχή 3 (Εικ. 6b), υποδεικνύοντας πιθανώς ότι η ευελιξία μεταξύ τομέων είναι ένα εξελικτικά διατηρημένο χαρακτηριστικό του SPACA6.Σύμφωνα με την ανάλυση ευκαμψίας, τα δεδομένα θερμικού τήγματος CD έδειξαν ότι το SPACA6 (Tm = 51,2°C) είναι λιγότερο σταθερό από το IZUMO1 (Tm = 62,9°C) (Εικ. S1e και S19).
a εικόνες H-DXMS των SPACA6 και b IZUMO1.Η ποσοστιαία ανταλλαγή δευτερίου προσδιορίστηκε στα υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία.Τα επίπεδα ανταλλαγής υδρογόνου-δευτερίου υποδεικνύονται με χρώμα σε μια κλίμακα από μπλε (10%) έως κόκκινο (90%).Τα μαύρα κουτιά αντιπροσωπεύουν περιοχές υψηλής ανταλλαγής.Τα όρια του 4HB, της άρθρωσης και της περιοχής παρόμοιας με Ig που παρατηρούνται στην κρυσταλλική δομή φαίνονται πάνω από την κύρια αλληλουχία.Τα επίπεδα ανταλλαγής δευτερίου στα 10 s, 1000 s και 100.000 s σχεδιάστηκαν σε ένα διάγραμμα λωρίδων που τοποθετήθηκε πάνω στις διαφανείς μοριακές επιφάνειες των SPACA6 και IZUMO1.Τμήματα δομών με επίπεδο ανταλλαγής δευτερίου κάτω από 50% είναι χρωματισμένα με λευκό.Οι περιοχές άνω του 50% της ανταλλαγής H-DXMS χρωματίζονται σε κλίμακα κλίσης.
Η χρήση γενετικών στρατηγικών CRISPR/Cas9 και γονιδίου ποντικού knockout οδήγησε στον εντοπισμό αρκετών παραγόντων σημαντικών για τη δέσμευση και τη σύντηξη σπέρματος και ωαρίων.Εκτός από την καλά χαρακτηρισμένη αλληλεπίδραση της δομής IZUMO1-JUNO και CD9, οι περισσότερες από τις πρωτεΐνες που σχετίζονται με τη σύντηξη γαμετών παραμένουν δομικά και λειτουργικά αινιγματικές.Ο βιοφυσικός και δομικός χαρακτηρισμός του SPACA6 είναι ένα άλλο κομμάτι του μοριακού παζλ προσκόλλησης/σύντηξης κατά τη γονιμοποίηση.
Το SPACA6 και άλλα μέλη της υπεροικογένειας IST φαίνεται να διατηρούνται σε μεγάλο βαθμό στα θηλαστικά καθώς και σε μεμονωμένα πουλιά, ερπετά και αμφίβια.Στην πραγματικότητα, πιστεύεται ότι το SPACA6 απαιτείται ακόμη και για γονιμοποίηση σε ζέβρα 59. Αυτή η κατανομή είναι παρόμοια με άλλες γνωστές πρωτεΐνες που σχετίζονται με τη σύντηξη γαμετών όπως οι DCST134, DCST234, FIMP31 και SOF132, υποδηλώνοντας ότι αυτοί οι παράγοντες είναι ανεπαρκείς σε HAP2 (επίσης γνωστές ως GCS1) πρωτεΐνες που είναι υπεύθυνες για την καταλυτική δραστηριότητα πολλών πρωτιστών., φυτά και αρθρόποδα.Γονιμοποιημένες πρωτεΐνες σύντηξης 60, 61. Παρά την ισχυρή δομική ομοιότητα μεταξύ SPACA6 και IZUMO1, τα γονίδια που κωδικοποιούν οποιαδήποτε από αυτές τις πρωτεΐνες οδήγησαν σε στειρότητα σε αρσενικά ποντίκια, υποδεικνύοντας ότι οι λειτουργίες τους στη σύντηξη γαμετών δεν είναι διπλές..Γενικότερα, καμία από τις γνωστές πρωτεΐνες του σπέρματος που απαιτούνται για τη φάση προσκόλλησης της σύντηξης δεν είναι περιττή.
Παραμένει ένα ανοιχτό ερώτημα εάν το SPACA6 (και άλλα μέλη της υπεροικογένειας IST) συμμετέχουν σε διαγαματικές διασταυρώσεις, σχηματίζουν ενδογαματικά δίκτυα για να στρατολογήσουν σημαντικές πρωτεΐνες σε σημεία σύντηξης ή ίσως ακόμη και να λειτουργούν ως άπιαστα συντηγόνα.Μελέτες συν-ανοσοκαθίζησης σε κύτταρα HEK293T αποκάλυψαν μια αλληλεπίδραση μεταξύ πλήρους μήκους IZUMO1 και SPACA632.Ωστόσο, οι ανασυνδυασμένοι εξωτομείς μας δεν αλληλεπιδρούσαν in vitro, υποδηλώνοντας ότι οι αλληλεπιδράσεις που παρατηρήθηκαν στους Noda et al.και τα δύο διαγράφηκαν στο κατασκεύασμα (σημειώστε την κυτταροπλασματική ουρά του IZUMO1, η οποία έχει αποδειχθεί ότι δεν είναι απαραίτητη για γονιμοποίηση62).Εναλλακτικά, το IZUMO1 και/ή το SPACA6 μπορεί να απαιτούν ειδικά περιβάλλοντα δέσμευσης που δεν αναπαράγουμε in vitro, όπως φυσιολογικά ειδικές διαμορφώσεις ή μοριακά σύμπλοκα που περιέχουν άλλες πρωτεΐνες (γνωστές ή μη ανακαλυφθείσες ακόμη).Παρόλο που πιστεύεται ότι η εξωτομή IZUMO1 μεσολαβεί στην προσκόλληση των σπερματοζωαρίων στο ωάριο στον περιβιλλικό χώρο, ο σκοπός της εξωτομής SPACA6 είναι ασαφής.
Η δομή του SPACA6 αποκαλύπτει αρκετές διατηρημένες επιφάνειες που μπορεί να εμπλέκονται σε αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης.Το διατηρημένο τμήμα της περιοχής άρθρωσης που βρίσκεται αμέσως δίπλα στο μοτίβο CXXC (που ορίζεται ως Patch 1 παραπάνω) έχει αρκετά αρωματικά υπολείμματα που βλέπουν προς τα έξω που συχνά συνδέονται με υδρόφοβες και π-στοιβακτικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ βιομορίων.Οι ευρείες πλευρές της περιοχής που μοιάζει με Ig (περιοχή 2) σχηματίζουν μια θετικά φορτισμένη αύλακα με εξαιρετικά διατηρημένα υπολείμματα Arg και His, και αντισώματα εναντίον αυτής της περιοχής έχουν χρησιμοποιηθεί προηγουμένως για να εμποδίσουν τη σύντηξη γαμετών 30 .Το αντίσωμα αναγνωρίζει τον γραμμικό επίτοπο 212RIRPAQLTHRGTFS225, ο οποίος έχει τρία από τα έξι υπολείμματα αργινίνης και εξαιρετικά συντηρημένο His220.Δεν είναι σαφές εάν η δυσλειτουργία οφείλεται σε απόφραξη αυτών των συγκεκριμένων υπολειμμάτων ή σε ολόκληρη την περιοχή.Η θέση αυτού του κενού κοντά στο C-άκρο του β-σάντουιτς υποδεικνύει cis-αλληλεπιδράσεις με γειτονικές πρωτεΐνες σπέρματος, αλλά όχι με πρωτεΐνες ωοκυττάρων.Επιπλέον, η διατήρηση ενός εξαιρετικά εύκαμπτου κουβάρι πλούσιου σε προλίνη (θέση 3) εντός της άρθρωσης μπορεί να είναι η θέση μιας αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης-πρωτεΐνης ή, πιο πιθανό, να υποδεικνύει τη διατήρηση της ευελιξίας μεταξύ των δύο περιοχών.Το φύλο είναι σημαντικό για τον άγνωστο ρόλο του SPACA6.σύντηξη γαμετών.
Το SPACA6 έχει ιδιότητες πρωτεϊνών διακυτταρικής προσκόλλησης, συμπεριλαμβανομένων β-σάντουιτς τύπου Ig.Πολλές συγκολλητικές πρωτεΐνες (π.χ. καντερίνες, ιντεγκρίνες, προσκολλητίνες και IZUMO1) διαθέτουν μία ή περισσότερες περιοχές β-σάντουιτς που επεκτείνουν τις πρωτεΐνες από την κυτταρική μεμβράνη στους περιβαλλοντικούς τους στόχους63,64,65.Η περιοχή που μοιάζει με Ig του SPACA6 περιέχει επίσης ένα μοτίβο που βρίσκεται συνήθως σε β-σάντουιτς προσκόλλησης και συνοχής: διπλές παράλληλες κλώνες στα άκρα των β-σάντουιτς, γνωστές ως μηχανικοί σφιγκτήρες66.Πιστεύεται ότι αυτό το μοτίβο αυξάνει την αντίσταση στις δυνάμεις διάτμησης, κάτι που είναι πολύτιμο για τις πρωτεΐνες που εμπλέκονται στις μεσοκυτταρικές αλληλεπιδράσεις.Ωστόσο, παρά αυτή την ομοιότητα με τις προσκολλητίνες, δεν υπάρχουν προς το παρόν στοιχεία ότι το SPACA6 αλληλεπιδρά με τα ασπράδια αυγών.Η εξωτομή SPACA6 δεν μπορεί να συνδεθεί με το JUNO και τα κύτταρα HEK293T που εκφράζουν το SPACA6, όπως φαίνεται εδώ, δύσκολα αλληλεπιδρούν με ωοκύτταρα που στερούνται ζώνης 32 .Εάν το SPACA6 δημιουργεί διαγαμητικούς δεσμούς, αυτές οι αλληλεπιδράσεις μπορεί να απαιτούν μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις ή σταθεροποίηση από άλλες πρωτεΐνες σπέρματος.Προς υποστήριξη της τελευταίας υπόθεσης, τα σπερματοζωάρια με έλλειψη IZUMO1 συνδέονται με ωοκύτταρα, αποδεικνύοντας ότι μόρια άλλα από το IZUMO1 εμπλέκονται στο στάδιο προσκόλλησης γαμετών 27 .
Πολλές ιικές, κυτταρικές και αναπτυξιακές πρωτεΐνες σύντηξης έχουν ιδιότητες που προβλέπουν τη λειτουργία τους ως συντηκτογόνα.Για παράδειγμα, οι γλυκοπρωτεΐνες σύντηξης ιού (τάξεις Ι, II και III) έχουν ένα υδρόφοβο πεπτίδιο σύντηξης ή βρόχο στο άκρο της πρωτεΐνης που εισάγεται στη μεμβράνη του ξενιστή.Ο χάρτης υδροφιλικότητας του IZUMO143 και η δομή (που προσδιορίστηκε και προβλέφθηκε) της υπεροικογένειας IST δεν έδειξε εμφανές υδρόφοβο πεπτίδιο σύντηξης.Έτσι, εάν οποιεσδήποτε πρωτεΐνες στην υπεροικογένεια IST λειτουργούν ως συντηκογόνα, το κάνουν με διαφορετικό τρόπο από άλλα γνωστά παραδείγματα.
Συμπερασματικά, οι λειτουργίες των μελών της υπεροικογένειας πρωτεϊνών IST που σχετίζονται με τη σύντηξη γαμετών παραμένουν ένα δελεαστικό μυστήριο.Το χαρακτηρισμένο ανασυνδυασμένο μόριο SPACA6 και η αναλυμένη δομή του θα παρέχουν πληροφορίες για τις σχέσεις μεταξύ αυτών των κοινών δομών και τον ρόλο τους στην προσκόλληση και τη σύντηξη γαμετών.
Η αλληλουχία DNA που αντιστοιχεί στον προβλεπόμενο ανθρώπινο εξωτομέα SPACA6 (αριθμός πρόσβασης NCBI NP_001303901.1, υπολείμματα 27-246) βελτιστοποιήθηκε με κωδικόνιο για έκφραση σε κύτταρα Drosophila melanogaster S2 και συντέθηκε ως γονίδιο με το θραύσμα αλληλουχίας GenicsE που κωδικοποιεί KozakomE., το σήμα έκκρισης BiP και τα αντίστοιχα άκρα 5' και 3' για ανεξάρτητη από σύνδεση κλωνοποίηση αυτού του γονιδίου σε φορέα έκφρασης ρΜΤ που βασίζεται σε προαγωγέα μεταλλοθειονίνης τροποποιημένο για επιλογή με πουρομυκίνη (pMT-puro).Ο φορέας pMT-puro κωδικοποιεί μια θέση διάσπασης θρομβίνης που ακολουθείται από μια C-τελική ετικέτα 10x-His (Εικόνα S2).
Η σταθερή επιμόλυνση του φορέα SPACA6 pMT-puro σε κύτταρα D. melanogaster S2 (Gibco) διεξήχθη παρόμοια με το πρωτόκολλο που χρησιμοποιήθηκε για τα IZUMO1 και JUNO43.Τα κύτταρα S2 αποψύχθηκαν και αναπτύχθηκαν σε μέσο Schneider (Gibco) συμπληρωμένο με τελική συγκέντρωση 10% (ν/ν) εμβρυϊκό ορό μόσχου απενεργοποιημένου με θερμότητα (Gibco) και 1Χ αντιμυκητιασικό αντιβιοτικό (Gibco).Κύτταρα πρώιμης διέλευσης (3,0 χ 106 κύτταρα) επιστρώθηκαν σε μεμονωμένα φρεάτια πλακών 6 φρεατίων (Corning).Μετά από 24 ώρες επώασης στους 27°C, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με ένα μείγμα 2 mg του φορέα SPACA6 pMT-puro και του αντιδραστηρίου επιμόλυνσης Effectene (Qiagen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.Τα επιμολυσμένα κύτταρα επωάστηκαν για 72 ώρες και στη συνέχεια συλλέχθηκαν με 6 mg/ml πουρομυκίνης.Τα κύτταρα στη συνέχεια απομονώθηκαν από πλήρες μέσο Schneider και τοποθετήθηκαν σε μέσο χωρίς ορό Insect-XPRESS (Lonza) για παραγωγή πρωτεΐνης μεγάλης κλίμακας.Μια παρτίδα 1 L κυτταροκαλλιέργειας S2 αναπτύχθηκε σε κύτταρα 8–10 × 106 ml-1 σε μια αεριζόμενη φιάλη Erlenmeyer με επίπεδο πυθμένα 2 L και στη συνέχεια αποστειρώθηκε με τελική συγκέντρωση 500 μM CuSO4 (Millipore Sigma) και διηθήθηκε στείρα.που προκαλείται.Οι επαγόμενες καλλιέργειες επωάστηκαν στους 27°C στις 120 rpm για τέσσερις ημέρες.
Το ρυθμισμένο μέσο που περιέχει SPACA6 απομονώθηκε με φυγοκέντρηση στα 5660xg στους 4°C ακολουθούμενο από ένα σύστημα διήθησης εφαπτομενικής ροής Centramate (Pall Corp) με μεμβράνη MWCO 10 kDa.Εφαρμόστε συμπυκνωμένο μέσο που περιέχει SPACA6 σε στήλη ρητίνης αγαρόζης Ni-NTA (Qiagen) 2 ml.Η ρητίνη Ni-NTA πλύθηκε με 10 όγκους στήλης (CV) ρυθμιστικού διαλύματος Α και στη συνέχεια προστέθηκε 1 CV ρυθμιστικού διαλύματος Α για να δώσει τελική συγκέντρωση ιμιδαζόλης 50 mM.Το SPACA6 εκλούστηκε με 10 ml ρυθμιστικού διαλύματος Α συμπληρωμένου με ιμιδαζόλη σε τελική συγκέντρωση 500 mM.Θρομβίνη κατηγορίας περιορισμού (Millipore Sigma) προστέθηκε απευθείας στη σωλήνωση αιμοκάθαρσης (MWCO 12-14 kDa) σε 1 μονάδα ανά mg SPACA6 έναντι 1 L 10 mM Tris-HCl, ρΗ 7,5 και 150 mM NaCl (ρυθμιστικό διάλυμα Β) για αιμοκάθαρση.) στους 4°C για 48 ώρες.Το διασπασμένο με θρομβίνη SPACA6 στη συνέχεια αραιώθηκε τρεις φορές για να μειωθεί η συγκέντρωση άλατος και φορτώθηκε σε στήλη κατιονανταλλαγής 1 ml MonoS 5/50 GL (Cytiva/GE) εξισορροπημένη με 10 mM Tris-HCl, ρΗ 7,5.Ο εναλλάκτης κατιόντων πλύθηκε με 3 ΟΚ 10 mM Tris-HCl, ρΗ 7,5, μετά το SPACA6 εκλούστηκε με γραμμική βαθμίδωση από 0 έως 500 mm NaCl σε 10 mm Tris-HCl, ρΗ 7,5 για 25 ΟΚ.Μετά από χρωματογραφία ανταλλαγής ιόντων, το SPACA6 συμπυκνώθηκε στο 1 ml και εκλούστηκε ισοκρατικά από στήλη ENrich SEC650 10 x 300 (BioRad) εξισορροπημένη με ρυθμιστικό διάλυμα Β. Σύμφωνα με το χρωματογράφημα, τα κλάσματα συνένωσης και συμπυκνώματος που περιέχουν SPACA6.Η καθαρότητα ελέγχθηκε με ηλεκτροφόρηση χρωματισμένη με Coomassie σε γέλη 16% SDS-πολυακρυλαμιδίου.Η συγκέντρωση πρωτεΐνης ποσοτικοποιήθηκε με απορρόφηση στα 280 nm χρησιμοποιώντας τον νόμο Beer-Lambert και τον θεωρητικό συντελεστή μοριακής απόσβεσης.
Καθαρισμένο SPACA6 υποβλήθηκε σε διαπίδυση όλη τη νύχτα έναντι 10 mM φωσφορικού νατρίου, ρΗ 7,4 και 150 mM NaF και αραιώθηκε σε 0,16 mg/mL πριν από την ανάλυση με φασματοσκοπία CD.Η φασματική σάρωση CD με μήκος κύματος 185 έως 260 nm συλλέχθηκε σε φασματοπολόμετρο Jasco J-1500 χρησιμοποιώντας κυψελίδες χαλαζία με μήκος οπτικής διαδρομής 1 mm (Helma) στους 25°C με ρυθμό 50 nm/min.Τα φάσματα CD διορθώθηκαν στη γραμμή βάσης, υπολογίστηκαν κατά μέσο όρο σε 10 αποκτήσεις και μετατράπηκαν σε μέση υπολειπόμενη ελλειπτικότητα (θMRE) σε βαθμούς cm2/dmol:
όπου MW είναι το μοριακό βάρος κάθε δείγματος σε Da.Ν είναι ο αριθμός των αμινοξέων.θ είναι η ελλειπτικότητα σε χιλιοστά μοίρες.Το d αντιστοιχεί στο μήκος της οπτικής διαδρομής σε cm.συγκέντρωση πρωτεΐνης σε μονάδες.