347 χημικό συστατικό τυλιγμένων σωλήνων από ανοξείδωτο χάλυβα, Προσδιορισμός νέων πρωτεϊνών συνοδού ανθρώπινων λευκοκυττάρων αντιγόνου-Α (HLA-A) που ανταποκρίνονται στην ιντερφερόνη με χρήση φασματομετρίας μάζας διασταυρούμενης σύνδεσης (CLMS)

Σας ευχαριστούμε που επισκεφτήκατε το Nature.com.Χρησιμοποιείτε μια έκδοση προγράμματος περιήγησης με περιορισμένη υποστήριξη CSS.Για την καλύτερη εμπειρία, συνιστούμε να χρησιμοποιήσετε ένα ενημερωμένο πρόγραμμα περιήγησης (ή να απενεργοποιήσετε τη λειτουργία συμβατότητας στον Internet Explorer).Επιπλέον, για να διασφαλίσουμε τη συνεχή υποστήριξη, εμφανίζουμε τον ιστότοπο χωρίς στυλ και JavaScript.
Ρυθμιστικά που εμφανίζουν τρία άρθρα ανά διαφάνεια.Χρησιμοποιήστε τα κουμπιά πίσω και επόμενο για να μετακινηθείτε στις διαφάνειες ή τα κουμπιά του ελεγκτή ολίσθησης στο τέλος για να μετακινηθείτε σε κάθε διαφάνεια.

περιγραφή προϊόντος

Σωλήνες πηνίου 347L από ανοξείδωτο χάλυβα, Κατηγορία χάλυβα: SS347L

Το σύστημα σηματοδότησης ιντερφερόνης επάγει μια ισχυρή απόκριση κυτοκίνης σε ένα ευρύ φάσμα παθογόνων και εγγενών παθολογικών σημάτων από το περιβάλλον, με αποτέλεσμα την επαγωγή υποομάδων πρωτεϊνών που επάγονται από την ιντερφερόνη.Εφαρμόσαμε φασματομετρία μάζας διασταυρούμενης σύνδεσης με μεσολάβηση DSS (CLMS) για να ανιχνεύσουμε νέες αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης στον τομέα των πρωτεϊνών που προκαλούνται από ιντερφερόνη.Εκτός από τις αναμενόμενες επαγώγιμες από ιντερφερόνη πρωτεΐνες, εντοπίσαμε επίσης νέα διαμοριακά και ενδομοριακά διασυνδεδεμένα προϊόντα προσθήκης κανονικών επαγώγιμων από ιντερφερόνη πρωτεϊνών όπως MX1, USP18, OAS3 και STAT1.Εστιάσαμε στην ορθογώνια επικύρωση ενός νέου συνόλου επαγώγιμων από ιντερφερόνη πρωτεϊνικών δικτύων που σχηματίζονται από πρωτεΐνες HLA-A (H2BFS-HLA-A-HMGA1) χρησιμοποιώντας συν-ανοσοκαθίζηση και την περαιτέρω μελέτη τους χρησιμοποιώντας μοντελοποίηση μοριακής δυναμικής.Η μοντελοποίηση της δυναμικής διαμόρφωσης του συμπλέγματος πρωτεΐνης αποκάλυψε αρκετές θέσεις αλληλεπίδρασης που αντανακλούσαν τις αλληλεπιδράσεις που προσδιορίστηκαν στα ευρήματα CLMS.Μαζί, παρουσιάζουμε μια πιλοτική μελέτη του CLMS για τον εντοπισμό νέων συμπλεγμάτων σηματοδότησης που προκαλούνται από την ιντερφερόνη και προσβλέπουμε στην ευρύτερη χρήση του CLMS για τον εντοπισμό νέων δυναμικών αλληλεπιδράσεων πρωτεϊνών στο μικροπεριβάλλον του όγκου.
Πριν ξεκινήσει μια προσαρμοστική ανοσολογική απόκριση, το έμφυτο αμυντικό σύστημα του ξενιστή δημιουργεί μια αντιμικροβιακή απόκριση με τη μεσολάβηση μιας οικογένειας εκκρινόμενων άλφα-ελικοειδών κυτοκινών που ονομάζονται ιντερφερόνες (IFNs).Οι κατηγορίες IFN τύπου Ι IFNα και IFNβ ενεργοποιούν τις κυτταρικές αποκρίσεις, συμπεριλαμβανομένων των αντιικών, προαποπτωτικών, προφλεγμονωδών και αντιπολλαπλασιαστικών καταστάσεων.Στους ανθρώπους, είναι γνωστοί 13 υποτύποι IFNa, όλοι συγκεντρωμένοι στο χρωμόσωμα 91. Παραδόξως, μόνο η IFNα2 έχει μελετηθεί για κλινική χρήση.Πρόσφατα, έχει δοθεί ιδιαίτερη προσοχή στην έρευνα για άλλους υποτύπους IFNα.Μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι η IFNα14 είναι μια από τις πιο αποτελεσματικές ισομορφές στον περιορισμό της αντιγραφής του HBV2 και του HIV-13,4 σε σύγκριση με τον κανονικό υποτύπο IFNα2.
Έχει διαπιστωθεί ότι τα ενεργοποιημένα σύμπλοκα υποδοχέα ιντερφερόνης τύπου Ι (IFNAR1 και IFNAR2) πυροδοτούν έναν καταρράκτη μεταγωγής σήματος που μεσολαβείται από τις κινάσες Janus TYK2 και JAK15,6.Αυτές οι κινάσες Janus φωσφορυλιώνουν μετατροπείς σήματος και ενεργοποιητές μεταγραφικής πρωτεΐνης (STAT1 και STAT2) σε υπολείμματα τυροσίνης για την έναρξη ετεροδιμερισμού που προκαλείται από την περιοχή SH26.Στη συνέχεια, το IRF9 δεσμεύει τα ετεροδιμερή STAT για να σχηματίσει ένα τριμερές σύμπλοκο του διεγερμένου από IFN γονιδίου του παράγοντα 3 (ISGF3), το οποίο μετατοπίζεται στον πυρήνα και προκαλεί τη μεταγραφή περισσότερων από 2000 διεγερμένων από ιντερφερόνη γονιδίων (ISGs)5,6,7,8.
Τα ISG αποτελούν τη ραχοκοκαλιά του έμφυτου ανοσοποιητικού συστήματος, ειδικά ως απάντηση σε ιογενή επίθεση.Ως πρώτη γραμμή άμυνας έναντι της ιογενούς μόλυνσης, τα κύτταρα αναπτύσσουν γρήγορα εκτεταμένες αλληλεπιδράσεις κυτταρικών πρωτεϊνών με ένα ευρύ φάσμα βιολογικών δραστηριοτήτων.Αυτές οι πρωτεΐνες περιλαμβάνουν υποδοχείς αναγνώρισης προτύπων, μόρια σηματοδότησης, μεταγραφικούς παράγοντες και πρωτεΐνες με άμεσες αντιικές λειτουργίες, καθώς και αρνητικούς ρυθμιστές των ανοσολογικών αποκρίσεων9.Πολλές από τις πληροφορίες για τη δραστηριότητα ISG προέρχονται από λειτουργικές οθόνες που χρησιμοποιούν οθόνες υπερέκφρασης10,11 ή τεχνικές σίγησης γονιδίων (siRNA, RNAi και CRISPR)12,13 στις οποίες εκφράζονται ή αναστέλλονται μεμονωμένα ISG και ελέγχεται η δράση τους σε διάφορους ιούς.Αν και αυτές οι μελέτες έχουν καθορίσει τις αντιικές ιδιότητες μεμονωμένων ISG, οι υποκείμενοι μοριακοί μηχανισμοί κάθε ISG παραμένουν σε μεγάλο βαθμό άγνωστοι.Είναι γενικά αποδεκτό ότι πολλές πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν με μία ή περισσότερες κυτοκίνες για να εξασφαλίσουν πλήρη δραστηριότητα, επομένως είτε τα ISG αλληλεπιδρούν άμεσα είτε οι αλληλεπιδράσεις τους διαμεσολαβούνται από κυτταρικές πρωτεΐνες.Για παράδειγμα, μια πρόσφατη μελέτη πρωτεωμικής φωτοδιασταυρούμενης σύνδεσης αναγνώρισε την ATPase VCP/p97 ως κύριο συνεργάτη αλληλεπίδρασης IFITM3, η αναστολή του οποίου οδηγεί σε ελαττώματα στη λυσοσωμική ταξινόμηση, τον κύκλο εργασιών και τη συνμεταφορά του IFITM3 με ιικά σωματίδια 14 .Χρησιμοποιώντας την ανοσοκατακρήμνιση, αναγνωρίσαμε την VAPA, μια πρωτεΐνη που σχετίζεται με κυστίδια, ως συνεργάτη αλληλεπίδρασης με το IFITM1/2/3 που μεσολαβεί στην ιική ωρίμανση με τη μεσολάβηση της χοληστερόλης, και αυτό επιβεβαιώθηκε από μια άλλη μελέτη που χρησιμοποιεί ένα σύστημα δύο υβριδίων ζυμομύκητα.Επιστημονική Υποστήριξη 15 , 16 .
Μια θεμελιώδης βιολογική διαδικασία που εμπλέκεται στην καταστολή της μόλυνσης και του κακοήθους μετασχηματισμού είναι η παρουσίαση αντιγόνου, η οποία μεσολαβείται από μόρια μείζονος συμπλέγματος ιστοσυμβατότητας (MHC).Πεπτίδια (μήκους 8-12 αμινοξέων) από διασπασμένες, πρόωρα τερματισμένες ή κακοδιπλωμένες πρωτεΐνες φορτώνονται στο ετεροδιμερές MHC-I (αποτελούμενο από βαριές και ελαφριές αλυσίδες MHC-I, που ονομάζονται β-2-μικροσφαιρίνη· β2Μ) 17,18.Τα προκύπτοντα σταθερά τριμερή MHC-I μεταφέρονται στην κυτταρική επιφάνεια, όπου παρουσιάζουν ενδοκυτταρικά πεπτίδια σε CD8+ Τ κύτταρα (κυτταροτοξικά Τ κύτταρα)17.Τα Τ κύτταρα αναγνωρίζουν και καταστρέφουν αυτά τα παθογόνα και τα κύτταρα που φέρουν ένα ειδικό για τον όγκο αντιγόνο.Κατά συνέπεια, τα παθογόνα και τα καρκινικά κύτταρα συχνά καταστέλλουν τη διαδικασία παρουσίασης αντιγόνου για να αποφύγουν την ανοσολογική επιτήρηση.Επιπλέον, το MHC-I ρυθμίζεται προς τα κάτω στο 40-90% των ανθρώπινων όγκων και συχνά σχετίζεται με χειρότερη πρόγνωση19.
Τα γονίδια που εμπλέκονται στην απόκριση στα παθογόνα πρέπει γρήγορα να εναλλάσσονται μεταξύ μιας κατάστασης ηρεμίας και μιας κατάστασης ενεργού μεταγραφής.Ως εκ τούτου, αρκετές κυτταρικές πρωτεΐνες υποτίθεται ότι εμπλέκονται στην απόκριση στην υψηλή ζήτηση IFN σε σύντομες χρονικές περιόδους, συμπεριλαμβανομένης της αναδιαμόρφωσης και της τροποποίησης της χρωματίνης προαγωγέα 20,21.Οι περισσότερες μελέτες έχουν επικεντρωθεί στην ταυτοποίηση μεμονωμένων εταίρων πρωτεΐνης ISG παρουσία IFN.Αρκετές πρωτεομικές και μεταγραφικές μελέτες σε μοντέλα κυττάρων έχουν αποσαφηνίσει την επίδραση της IFN στο κυτταρικό τοπίο.Ωστόσο, παρά την αυξανόμενη κατανόηση της δυναμικής που προκαλείται από τις ιντερφερόνες, εξακολουθούμε να γνωρίζουμε λίγα για τη συμμετοχή των ISG.Όταν εξετάζουμε την πολυπλοκότητα και τη χρονικά εξαρτώμενη δυναμική της σηματοδότησης ιντερφερόνης, προκύπτουν δύο ερωτήματα: (i) είναι δυνατόν να σταθεροποιηθούν και να παγιδευτούν τα συμπλέγματα πολυπρωτεϊνών που εμπλέκονται στη γρήγορη σηματοδότηση και (ii) μπορούν αυτές οι αλληλεπιδράσεις να χαρτογραφηθούν στον τρισδιάστατο χώρο;
Για να αντιμετωπίσουμε αυτά τα ζητήματα, εφαρμόσαμε χημική διασύνδεση με μεσολάβηση διηλεκτριμιδίου (DSS) σε συνδυασμό με φασματομετρία μάζας (CLMS) για να μελετήσουμε το δίκτυο αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης που προκαλείται από IFNα και τη δυναμική του.Το DSS προσθέτει ομοιοπολικούς δεσμούς μεταξύ εγγύς υπολειμμάτων πρωτεϊνών και/ή πρωτεϊνικών συμπλεγμάτων in vivo.Η επακόλουθη ανάλυση MS αποκαλύπτει συγκεκριμένες θέσεις διασύνδεσης που αντικατοπτρίζουν τη χωρική εγγύτητα περιοχών εντός μιας συγκεκριμένης πρωτεΐνης, που ονομάζονται εσωτερικοί δεσμοί ή υπομονάδες σε συμπλέγματα πρωτεϊνών, που ονομάζονται αλληλεπιδράσεις.Χρησιμοποιώντας αυτήν την προσέγγιση, έχουμε εντοπίσει πολλά νέα σύμπλοκα πρωτεΐνης-πρωτεΐνης καθώς και δίκτυα αλληλεπίδρασης πολλαπλών πρωτεϊνών που προκαλούνται από ιντερφερόνη.Δοκιμάζοντας περαιτέρω ένα υποσύνολο αυτών των νέων αλληλεπιδράσεων, αποδεικνύουμε ότι το H2BFS (H2B τύπου ιστόνης FS· στο εξής θα αναφέρεται ως H2B) και το MDN1 δρουν ως συνεργάτες σύνδεσης για το HLA-A.
Τα κύτταρα Flo-1 είναι ένα από τα πιο γνωστά in vitro μοντέλα αδενοκαρκινώματος οισοφάγου καθώς μιμούνται βασικά χαρακτηριστικά των όγκων του οισοφάγου22,23.Ωστόσο, δεν είναι όλοι οι όγκοι ανοσογονικοί και για να προσδιορίσουμε εάν τα κύτταρα Flo-1 ανταποκρίνονται στη θεραπεία με ιντερφερόνη, αντιμετωπίσαμε τα κύτταρα Flo-1 με 10 ng/ml IFNα για 72 ώρες.Τα κύτταρα Flo-1 έδειξαν πρώιμη επαγωγή pSTAT1 και IRF1, ξεκινώντας 2 ώρες μετά τη θεραπεία και συνεχίζοντας για 72 ώρες, με μια εξαρτώμενη από το χρόνο μείωση στα σταθερά επίπεδα του IRF1 (Εικόνα 1Α).Τα ISG (MX1, IFITM1, OAS1/2 και ISG15) βρέθηκαν να προκαλούνται έντονα μετά από 6 ώρες, μιμούμενοι τις κλασικές αποκρίσεις μέσης και όψιμης φάσης στην IFNα (Εικόνα 1Α).Μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι αυτό το κυτταρικό μοντέλο μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη μελέτη των αποκρίσεων ιντερφερόνης.
Διαφορικές αποκρίσεις έκφρασης πρωτεΐνης σε κύτταρα Flo-1 μετά από θεραπεία με IFNa.(Α) Η έκφραση πρωτεΐνης σε κύτταρα Flo-1 που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 ng/ml ΙΡΝα για 2, 6, 24, 48 και 72 ώρες αναλύθηκε με ανοσοστύπωμα χρησιμοποιώντας τα υποδεικνυόμενα αντισώματα ISG.(Β) Πηκτώματα SDS-PAGE χρωματισμένα με μπλε Coomassie εκχυλισμάτων ολόκληρων κυττάρων μετά από διασταυρούμενη σύνδεση με DSS για υποδεικνυόμενους χρόνους και συγκεντρώσεις.(Γ) Αντιπροσωπευτικό ανοσοστύπωμα που εξετάστηκε με αντίσωμα p53(DO-1) από τα ίδια δείγματα για να εκτιμηθεί ο βαθμός διασύνδεσης πρωτεΐνης.
Για να αποτυπώσουμε το τοπίο αλληλεπίδρασης πρωτεϊνών in situ, χρησιμοποιήσαμε το DSS, έναν ευρέως χρησιμοποιούμενο παράγοντα διασύνδεσης λόγω της υψηλής διαπερατότητας της μεμβράνης και του σχετικά μικρού χρόνου αντίδρασης.Ο μικρότερος χρόνος αντίδρασης βοηθά στην πρόληψη του σχηματισμού μεγάλων συσσωματωμάτων πρωτεϊνών με σταυροειδείς δεσμούς, διατηρώντας έτσι τη σταθερότητα του παράγοντα διασταύρωσης.Για να προσδιορίσουμε τη βέλτιστη συγκέντρωση DSS και να αποφύγουμε την υπερβολική σταυροσύνδεση, πρώτα εκθέσαμε τα κύτταρα σε 5, 2,5 και 1 mM DSS για 5, 10, 5 και 30 λεπτά, αντίστοιχα, και αναλύσαμε τα προϊόντα λύσης με SDS-PAGE χρωματισμένη με Coomassie (τα δεδομένα δεν εμφανίζονται) .Τα κυτταρολύματα φαίνεται να έχουν υψηλή διασύνδεση στη χαμηλότερη συγκέντρωση και στο συντομότερο χρονικό σημείο.Επομένως, το DSS τιτλοδοτήθηκε σε 1, 0,5 και 0,1 mM σε 5 λεπτά (Εικόνα 1Β).Η βέλτιστη διασύνδεση παρατηρήθηκε με 0,5 mM DSS για 5 λεπτά, και αυτές οι συνθήκες επιλέχθηκαν για κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με ΙΡΝα.Επιπλέον, το Σχήμα 1C δείχνει ένα στύπωμα Western που πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το αντίσωμα ρ53 (DO-1) για την αξιολόγηση του βαθμού διασταύρωσης πρωτεΐνης.
Τα κύτταρα Flo-1 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 ng/ml ΙΡΝα για 24 ώρες πριν από την προσθήκη του παράγοντα διασύνδεσης.Τα διασυνδεδεμένα κύτταρα στη συνέχεια λύθηκαν με πρωτεόλυση δύο σταδίων και οι πρωτεΐνες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με FASP (Εικ. 2) 24,25.Τα διασυνδεδεμένα τρυπτικά πεπτίδια αναλύθηκαν με φασματομετρία μάζας (Εικ. 2).Τα φάσματα MS/MS στη συνέχεια ταιριάζουν με την πρωτεϊνική αλληλουχία και ποσοτικοποιούνται με MaxQuant26,27.Τα διασυνδεδεμένα πεπτίδια ταυτοποιήθηκαν από τα ληφθέντα φάσματα χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα SIM-XL και μεμονωμένες ενώσεις συνδυάστηκαν σε ένα πολύπλοκο δίκτυο χρησιμοποιώντας τις σωλήνες λογισμικού υπολογιστικού ανοιχτού κώδικα xQuest28 και SIM-XL29 (Εικ. 2).Η SIM-XL προσδιορίζει τις αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης, τις εσωτερικές αλυσίδες και τις μεμονωμένες αλυσίδες σε απλά ή πολύπλοκα μείγματα πρωτεϊνών και παρέχει σενάρια για την οπτικοποίηση των αλληλεπιδράσεων σε δομές πρωτεΐνης.Επιπλέον, κατατάσσει κάθε διασταύρωση ως βαθμολογία ID σύμφωνα με την ποιότητα του φάσματος MS/MS29.Έχουν εντοπιστεί αρκετές εξαιρετικά αξιόπιστες αλληλεπιδράσεις και σύμπλοκα πρωτεΐνης-πρωτεΐνης και ένα νέο σύνολο αλληλεπιδράσεων έχει διερευνηθεί περαιτέρω χρησιμοποιώντας συν-ανοσοκαθίζηση και διαμορφωτικές αλλαγές συμπλόκων χρησιμοποιώντας μοντελοποίηση μοριακής δυναμικής (ΜΔ) (Εικ. 2) 30, 31.
Σχηματική επισκόπηση της μεθόδου CLMS.Τα κύτταρα Flo-1 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 ng/ml ΙΡΝα για 24 ώρες και ακολούθησε in situ διασύνδεση πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας DSS ακολουθούμενη από κυτταρική λύση και θρυψινοποίηση.Τα διασυνδεδεμένα δείγματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα φασματόμετρο μάζας Orbitrap και δειγματολήφθηκαν περαιτέρω για κατακερματισμό προδρόμου πεπτιδίων κατά τη διάρκεια LC-MS/MS.Δύο συνδεδεμένα πεπτίδια ταυτοποιήθηκαν από τα ληφθέντα φάσματα χρησιμοποιώντας τη μηχανή αναγνώρισης φάσματος του προγράμματος Crosslinked Peptides (SIM-XL) και όλες οι ενώσεις συνδυάστηκαν σε ένα πολύπλοκο δίκτυο χρησιμοποιώντας υπολογιστικές αγωγούς.Φιλτράρετε αλληλεπιδράσεις χαμηλής εμπιστοσύνης με βάση τις βαθμολογίες ψευδώς θετικού ποσοστού (FDR).Αρκετές νέες αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης υψηλής πιστότητας επιβεβαιώθηκαν περαιτέρω χρησιμοποιώντας συν-ανοσοκαθίζηση και οι διαμορφωτικές αλλαγές στα σύμπλοκα εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας μοντελοποίηση μοριακής δυναμικής (MD).
Συνολικά -30.500 και -28.500 πεπτίδια ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας MaxQuant σε μη διεγερμένα και διεγερμένα δείγματα IFNa, αντίστοιχα (Συμπληρωματικός Πίνακας S1, Σχήμα 3Α).Η κατανομή μήκους πεπτιδίου και στις δύο περιπτώσεις έδειξε υψηλότερη αναλογία μεγαλύτερων πεπτιδίων, υποδεικνύοντας την παρουσία πεπτιδίων διασυνδεδεμένων (Εικ. 3Β, Γ).Επιπλέον, ένα μεγαλύτερο ποσοστό μεγαλύτερων πεπτιδίων ήταν παρόν στην περιοχή 40-55 σε δείγματα που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με IFNa (Εικ. 3C).Η χαρτογράφηση πρωτεϊνών έναντι της έντασης log2 έδειξε ότι οι κλασικές πρωτεΐνες που διεγείρονται από ιντερφερόνη ήταν οι πιο άφθονες σε σύγκριση με δείγματα που δεν υποβλήθηκαν σε επεξεργασία, συμπεριλαμβανομένων των MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58 και HLA-F (Εικόνα 3D).Η ανάλυση των μονοπατιών για πρωτεΐνες περισσότερο από τρεις φορές εμπλουτισμένες σε απόκριση στη θεραπεία με IFNa χρησιμοποιώντας τη βάση δεδομένων μονοπατιού Reactome έδειξε ότι η παρουσίαση και η επεξεργασία του αντιγόνου με τη μεσολάβηση MHC-I ήταν η πιο κυρίαρχη οδός (Εικόνα 3Ε).Σε συμφωνία με προηγούμενες αναφορές, οι αντιικές αποκρίσεις που μεσολαβούνταν από το OAS και το ISG15 καθώς και η σηματοδότηση IFNα/β και κυτοκίνης ήταν μεταξύ των οδών που ενεργοποιήθηκαν.Επιπλέον, λυσίνη και σερίνη-ειδικές πρωτεϊνικές διασυνδέσεις ταυτοποιήθηκαν από τα αρχικά αποκτηθέντα φάσματα MS/MS χρησιμοποιώντας SIM-XL.Μια πρόσφατη μελέτη ανέφερε 104 ISG που καλύπτουν 20 ιούς από 9 κατηγορίες ιών με μετα-ανάλυση μεμονωμένων μελετών υπερέκφρασης ISG σε 5 τύπους κυττάρων9.Ωστόσο, για να ξεπεράσουμε τους υπολογιστικούς περιορισμούς της διαλογής μεγάλων συνόλων δεδομένων, ξεκινήσαμε με ένα μικρότερο σύνολο δεδομένων για να διερευνήσουμε πιθανές αλληλεπιδράσεις μεταξύ της λίστας των γονιδίων IRDS που αναφέρθηκαν από τους Padaria et al., τα περισσότερα από τα οποία είναι ISG.
Ταυτοποίηση διαφορικά εκφραζόμενων διασυνδεδεμένων πρωτεϊνών σε απόκριση στην IFNa (δεδομένα που λαμβάνονται από MaxQuant).(Α) Διάγραμμα Venn που αντιπροσωπεύει τον αριθμό των κοινών και αποκλειστικών πεπτιδίων που ταυτοποιήθηκαν σε δείγματα Flo-1 που έχουν υποστεί αγωγή με IFNa14 και χωρίς επεξεργασία.Κατανομή μήκους πεπτιδίου μη επεξεργασμένων (Β) και επεξεργασμένων με ΙΡΝα (C) δειγμάτων σταυροδεσμών.(D) Χάρτης θερμότητας που αντιπροσωπεύει το log2 (ένταση LFQ) μεταξύ μη επεξεργασμένων και επεξεργασμένων με IFNa14 κυττάρων Flo-1.Το αριστερό πλαίσιο δείχνει τις πρωτεΐνες που ενεργοποιούνται πιο ενεργά παρουσία IFNα.(Ε) Ιστόγραμμα που αντιπροσωπεύει τις 20 κύριες οδούς εμπλουτισμού μετά τη θεραπεία με IFNα.Η βάση δεδομένων μονοπατιού Reactome ανέλυσε περισσότερες από τετραπλάσιες αλλαγές σε ρυθμιζόμενες προς τα πάνω ανταποκρινόμενες στην IFNα πρωτεΐνες.
Η διέγερση ISG με τη μεσολάβηση ιντερφερόνης είναι καλά τεκμηριωμένη, αλλά σε μοριακό επίπεδο είναι ελάχιστα κατανοητό πώς αυτές οι πρωτεΐνες κορυφώνονται σε ένα ευρύ φάσμα βιολογικών λειτουργιών.Ερευνήσαμε τις αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών με υψηλό βαθμό εμπιστοσύνης μεταξύ γνωστών ISG.Είναι ενδιαφέρον ότι εντοπίσαμε ένα δίκτυο που περιλαμβάνει πρωτεΐνες MX1, USP18, ROBO1, OAS3 και STAT1 που σχηματίζουν ένα μεγάλο σύμπλεγμα ως απόκριση στη θεραπεία με IFNa (Εικόνα 4, Πίνακας S2) 32,33,34.Το πιο σημαντικό, αυτές οι αλληλεπιδράσεις βρέθηκαν σε όλα τα τριπλούν που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με IFNα και δεν βρέθηκαν σε δείγματα που δεν είχαν υποστεί αγωγή, υποδηλώνοντας ότι σχηματίστηκαν ειδικά ως απόκριση στη θεραπεία με IFNα.Είναι γνωστό ότι το STAT1 ρυθμίζει μεταγραφικά την έκφραση αυτών των ISG, αλλά η αλληλεπίδρασή του με τα ISG σε επίπεδο πρωτεΐνης δεν έχει μελετηθεί.Η κρυσταλλική δομή του STAT1 έδειξε ότι η ελικοειδής περιοχή του (CCD) δεν εμπλέκεται στην αλληλεπίδραση με το DNA ή τα πρωτομερή κατά τον σχηματισμό διμερών35.Αυτές οι α-έλικες σχηματίζουν μια δομή ελικοειδούς έλικας που παρέχει μια κυρίως υδρόφιλη επιφάνεια για να συμβαίνουν αλληλεπιδράσεις 35 .Στα δεδομένα μας CLMS, παρατηρήσαμε ότι οι περισσότερες από τις αλληλεπιδράσεις με το STAT1 συνέβησαν στον τομέα SH2 που προηγείται του CCD, του τομέα συνδέτη ή της C-τερματικής ουράς (υπολείμματα 700-708) (Εικόνα 4Α).Μια προηγούμενη μελέτη ανέφερε ότι το USP18 δεσμεύεται στον τομέα δέσμευσης CCD και DNA (DBD) του STAT2 και στρατολογείται στην υπομονάδα του υποδοχέα ιντερφερόνης τύπου Ι IFNAR2 για να μεσολαβήσει στην αναστολή της σηματοδότησης ιντερφερόνης τύπου Ι 24 .Τα δεδομένα μας έδειξαν επίσης ότι ο καταλυτικός τομέας USP18 αλληλεπιδρά με το STAT1 DBD (Εικόνα 4A,D), υποδηλώνοντας ότι τόσο το STAT1 όσο και το STAT2 μπορεί να διαδραματίσουν ρόλο στην προσέλκυση του USP18 στο IFNAR2.
Δίκτυο ISG πρωτεΐνης-πρωτεΐνης που ταυτοποιήθηκε σε διασυνδεδεμένα κύτταρα που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με IFNα.(Α) Δισδιάστατη γραφική παράσταση αλληλεπίδρασης που δείχνει αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης (που δημιουργούνται στο πρόγραμμα SIM-XL), με γραμμές που αντιπροσωπεύουν τις διαμοριακές αλληλεπιδράσεις (αποκοπή διασταύρωσης σε 3,5).Οι τομείς διαφορετικών ταυτοτήτων επισημαίνονται με το χρώμα τους32: τομέας MX1, Dynamin_N (73–249), Dynamin_M (259–547) και GED (569–660).Τομείς OAS3: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872) και OAS1_C (903-108).Τομέας ROBO1, Ig_3 (67–151), I-set (170–258), I-set (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678–758) και fn3 (777–864).Πεδία STAT1: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657) και STAT1_TAZ2bind (715–739).(Β) Κυκλική προβολή διασυνδεδεμένων πρωτεϊνών (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1 και STAT1) με αλληλεπιδράσεις και αλληλεπιδράσεις που επισημαίνονται με μπλε και κόκκινο χρώμα, αντίστοιχα.Το όριο διασύνδεσης ορίστηκε στο 3,5.Τα διαγράμματα κουκκίδων δείχνουν θέσεις αλληλεπίδρασης STAT1 με MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E) και OAS3 (F), καθώς και θέσεις αλληλεπίδρασης K ή S μεταξύ των δύο πεπτιδίων.Στο σχήμα, το όριο βαθμολογίας διασύνδεσης έχει οριστεί σε 3,0.(Ζ) Διάφορες θέσεις αλληλεπίδρασης μεταξύ των περιοχών STAT1 και OAS3 DI που υπερτίθενται στις πρωτεϊνικές δομές τους σε PyMol (σύστημα μοριακών γραφικών PyMOL, έκδοση 2.0 Schrödinger, LLC.).STAT1 (pdb id: 1bf533) και OAS3 (pdb id: 4s3n34).) πρόγραμμα.
Δύο ισομορφές του USP18 έχουν περιγραφεί σε ανθρώπους, μια πρωτεΐνη πλήρους μήκους που βρίσκεται κυρίως στον πυρήνα και μια ισομορφή χωρίς Ν-τελική περιοχή, η USP18-sf, η οποία είναι ομοιόμορφα κατανεμημένη στο κυτταρόπλασμα και στον πυρήνα 36 .Επιπλέον, το Ν-άκρο προβλέφθηκε ότι δεν είναι δομημένο και δεν απαιτεί δραστικότητα ισοπεπτιδάσης ή δέσμευση ISG1537.Οι περισσότερες από τις αλληλεπιδράσεις που εντοπίστηκαν στη μελέτη μας εντοπίστηκαν στο Ν-άκρο της πρωτεΐνης, υποδηλώνοντας ότι αυτές οι αλληλεπιδράσεις περιλαμβάνουν πλήρους μήκους USP18 (Εικόνα 4Α, Δ) και επομένως πιθανόν να συμβαίνουν στον πυρήνα.Επιπλέον, τα δεδομένα μας υποδεικνύουν επίσης ότι το Ν-άκρο είναι εξειδικευμένο για αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης προς πρωτεΐνη.Η θέση δέσμευσης IFNAR2 βρίσκεται μεταξύ των υπολειμμάτων 312-368, και συγκεκριμένα, καμία από τις πρωτεΐνες στο σύμπλοκο δεν δεσμεύεται σε αυτή την περιοχή (Εικ. 4Α) 37,38.Αυτά τα δεδομένα μαζί υποδεικνύουν ότι η περιοχή δέσμευσης IFNAR2 χρησιμοποιείται αποκλειστικά από την πρωτεΐνη υποδοχέα.Επιπλέον, μόνο το OAS3 και το ROBO1 βρέθηκαν να συσχετίζονται με τομείς ανάντη του Ν-άκρου και της θέσης δέσμευσης IFNAR2 (Εικόνα 4Α).
Το ROBO1 ανήκει στην υπεροικογένεια των ανοσοσφαιρινών (Ig) των διαμεμβρανικών σηματοδοτικών μορίων και αποτελείται από πέντε τομείς Ig και τρεις τομείς ινονεκτίνης (Fn) στην εξωκυτταρική περιοχή.Αυτές οι εξωκυτταρικές περιοχές ακολουθούνται από μια εγγύς περιοχή μεμβράνης και μια μονή διαμεμβρανική έλικα 39. Μια αδόμητη ενδοκυτταρική περιοχή βρίσκεται στο C-άκρο και περιέχει διατηρημένα μοτίβα αλληλουχίας που μεσολαβούν στη δέσμευση πρωτεΐνης τελεστή39.Η περιοχή που εκτείνεται από τα αμινοξέα ~1100 έως 1600 είναι ως επί το πλείστον διαταραγμένη.Βρήκαμε ότι το MX1 αλληλεπιδρά με το ROBO1 μέσω Ig, Fn και ενδοκυτταρικών περιοχών, ενώ οι περισσότερες αλληλεπιδράσεις με το STAT1 συμβαίνουν μεταξύ του CCD, του τομέα συνδέτη και του C-άκρου του ROBO1 (Εικ. 4Α, Ε).Από την άλλη πλευρά, οι αλληλεπιδράσεις με τις περιοχές συνδέτη DI, DIII και OAS3 κατανεμήθηκαν σε όλη την πρωτεΐνη ROBO1 (Εικ. 4Α).
Η οικογένεια πρωτεϊνών ολιγοαδενυλικής συνθάσης (OAS) δέχεται και δεσμεύει το ενδοκυτταρικό δίκλωνο RNA (dsRNA), υφίσταται αλλαγές διαμόρφωσης και συνθέτει 2',5'-συνδεδεμένα ολιγοαδενυλικά (2-5 As) 40 .Βρέθηκε ότι μεταξύ των τριών OAS, το OAS3 εμφανίζει την υψηλότερη συγγένεια για το dsRNA και συνθέτει τη μικρότερη ποσότητα 2-5 As, που μπορεί να ενεργοποιήσει την RNase L και έτσι να περιορίσει την αντιγραφή του ιού 41 .Η οικογένεια OAS αποτελείται από περιοχές νουκλεοτιδικής τρανσφεράσης που μοιάζουν με πολυμεράση βήτα (ροΙ-β).Προηγούμενη έρευνα έχει δείξει ότι η καταλυτική δραστηριότητα της Ο-τερματικής περιοχής (DIII) εξαρτάται από την περιοχή δέσμευσης dsRNA (DI), η οποία απαιτείται για την ενεργοποίηση του OAS342.Παρατηρήσαμε ότι οι περιοχές DI και DII του OAS3 αλληλεπιδρούν με το CCD και μια μικρή περιοχή διασταύρωσης μεταξύ SH2 και STAT1 TAD (Εικόνα 4A,F).Η επικάλυψη διαφορετικών θέσεων διασύνδεσης στη δομή της πρωτεΐνης αποκάλυψε μια αλληλεπίδραση μεταξύ του β-φύλλου και του βρόχου DBD STAT1 και ενός ανοιχτού θύλακα ή κοιλότητας που σχηματίζεται από τα υπολείμματα 60-75 στον τομέα DI του OAS3 (Εικ. 4G).Ο προσανατολισμός των πρωτεϊνών στο σύμπλεγμα έδειξε επίσης ότι καμία από τις αλληλεπιδράσεις με το OAS3 δεν παρενέβη στην ικανότητα δέσμευσης DNA του τομέα DI του (Εικ. S1A).Επιπλέον, η Ν-τερματική περιοχή της GTPase MX1 αλληλεπιδρά εκτενώς με τις περιοχές DI και DIII του OAS3 (Εικ. 4Α).Παρατηρήσαμε επίσης μια αλληλεπίδραση μεταξύ OAS1 και MX1 και στις τρεις επαναλήψεις που υποβλήθηκαν σε αγωγή με IFNa, όπου μια μεμονωμένη περιοχή OAS1 (επίσης καταλυτικά ενεργή) αλληλεπιδρά και με τις τρεις περιοχές MX1 (Εικόνα S2A,B).
Οι πρωτεΐνες MX αποτελούν μέρος μιας μεγάλης οικογένειας GTPασών που μοιάζουν με dynein που περιέχουν μια N-τερματική περιοχή GTPase που δεσμεύει και υδρολύει την GTP, μια ενδιάμεση περιοχή που μεσολαβεί στην αυτοσυναρμολόγηση και ένα C-τερματικό φερμουάρ λευκίνης που δρα ως GTPase (LZ ).τομέας τελεστής τομέα25,43.Το MX1 συνδέεται με υπομονάδες ιικών πολυμερασών για να εμποδίσει τη μεταγραφή του ιικού γονιδίου43.Μια προηγουμένως αναφερθείσα οθόνη δύο υβριδίων ζυμομύκητα έδειξε ότι το MX1 που σχετίζεται με το PIAS1 αναστέλλει την ενεργοποίηση γονιδίου που προκαλείται από STAT1 αναστέλλοντας τη δραστηριότητα δέσμευσης DNA και επίσης έχει δραστηριότητα λιγάσης SUMO E344,45.Εδώ, αποδεικνύουμε ότι το MX1 συνδέεται με το STAT1 (Εικόνα 4C,D), ωστόσο το πώς αυτή η αλληλεπίδραση επηρεάζει την ενεργοποίηση γονιδίου που προκαλείται από STAT1 σε απόκριση στην IFNα χρειάζεται περαιτέρω μελέτη.Επιπλέον, βρήκαμε επίσης ότι το MX1 αλληλεπιδρά με τα IFIT3 και DDX60 και στις τρεις επαναλήψεις που έχουν υποστεί αγωγή με IFNα (Εικ. S2C).
Το DDX60 είναι μια επαγόμενη από IFN κυτταροπλασματική ελικάση που έχει προηγουμένως αναφερθεί ότι παίζει ρόλο στην ανεξάρτητη από RIG-I αποικοδόμηση του ιικού RNA46.Αλληλεπιδρά με το RIG-I και ενεργοποιεί τη σηματοδότησή του με τρόπο ειδικό για τον συνδέτη.Οι περισσότερες από τις αλληλεπιδράσεις του με το MX1 και το IFIT3 συμβαίνουν εντός μακρών Ν- και C-τερματικών περιοχών χωρίς κανονικές περιοχές ή μοτίβα (Εικ. S2E,F).Ωστόσο, το MX1 σχετίζεται επίσης με τον τομέα ελικάσης DEXD/H-Box (Εικ. S2E).Οι πρωτεΐνες της οικογένειας IFIT έχουν διαδοχικά αντίγραφα ενός διακριτικού μοτίβου έλικας-στροφής-έλικας που ονομάζεται επανάληψη τετραπεπτιδίου (TPR).Το IFIT3 βρέθηκε ότι είναι ένας θετικός διαμορφωτής της σηματοδότησης RIG-I και ως εκ τούτου ένα συστατικό του συμπλέγματος MAVS.Συνολικά, τα δεδομένα μας υποδηλώνουν ότι τα IFIT3 και DDX60 αλληλεπιδρούν κυρίως στην περιοχή μεταξύ TPR 3-6 του IFIT3 και μπορεί να διαδραματίσουν ρόλο στη σηματοδότηση RIG-I/MAVS (Εικ. S2F).
Δεδομένου ότι η διαλογή ολόκληρου του πρωτεώματος είναι υπολογιστικά εντατική, στη συνέχεια εξετάσαμε ολόκληρη τη βάση δεδομένων του ανθρώπινου UniProt για την παρουσία μιας από τις επαναλήψεις που έχουν υποστεί αγωγή με IFNα.Σε αυτό το αντίγραφο, βρήκαμε αρκετά αξιόπιστα δίκτυα αλληλεπίδρασης για το HLA-A.Η ανάλυση των πρωτεϊνικών οδών που ταυτοποιήθηκαν από τα φάσματα MS/MS έδειξε ότι η επεξεργασία και η παρουσίαση του αντιγόνου που βασίζεται σε MHC-I είναι η κύρια οδός που προκαλείται από την ιντερφερόνη (Εικ. 3D).Ως εκ τούτου, επικεντρωθήκαμε στη μελέτη των πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων των μορίων MHC-I με υψηλό βαθμό εμπιστοσύνης σε όλα τα διασυνδεδεμένα δείγματα.Το HLA αποτελείται από περιοχές α1, α2 και α3 και ελαφριές αλυσίδες και η μικροσφαιρίνη β2 (β2m) είναι μια σταθερή πρωτεΐνη συνοδού49.Μόλις συναρμολογηθεί στο ενδοπλασματικό δίκτυο, το HLA είναι ασταθές απουσία πεπτιδικών συνδετών50.Η αύλακα δέσμευσης πεπτιδίου σχηματίζεται από τις εξαιρετικά πολυμορφικές και μη δομημένες περιοχές α1 και α2 σε μη πεπτιδική μορφή και τη σχετικά λιγότερο πολυμορφική περιοχή α351.Παρουσία IFNα, εντοπίσαμε δύο σύμπλοκα HLA-A: το ένα αλληλεπιδρά με HMGA1 και H2B (Εικόνα 5, Πίνακας S3) και το άλλο αλληλεπιδρά με MDN1, LRCH4 και H2B (Εικόνα 6).
Η IFNα επάγει ένα δίκτυο αλληλεπίδρασης HLA-A με H2B (H2BFS) και HMGA1.(Α) Δισδιάστατη γραφική παράσταση (δημιουργημένη σε λογισμικό SIM-XL) που απεικονίζει διαφορετικούς τύπους αλληλεπιδράσεων στο σύμπλεγμα H2B-HLA-A-HMGA1: διασύνδεση (μπλε), διασύνδεση (κόκκινο) και μονή ζεύξη (μαύρο)..Τομείς διαφορετικών ταυτοτήτων έχουν χρωματική κωδικοποίηση32: H2B (ιστόνη, 2–102) και MHC-I (MHC_1, 25–203, ομάδα C1, 210–290 και MHC_I_C, 337–364).Το όριο διασύνδεσης ορίστηκε στο 3,5.Τα διαγράμματα κουκκίδων δείχνουν θέσεις αλληλεπίδρασης HLA-A με H2B (B) και HMGA1 (C), καθώς και θέσεις αλληλεπίδρασης K ή S μεταξύ των δύο πεπτιδίων.Στο σχήμα, το όριο βαθμολογίας διασύνδεσης έχει οριστεί σε 3,0.(Δ) Σχέσεις μεταξύ πρωτεϊνών που εμφανίζονται στις δομές των πρωτεϊνών H2B, HLA-A και HMGA1 στο πρόγραμμα PyMOL.Αυτές οι δομές μοντελοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας τον διακομιστή Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) και οι δομές προτύπου για τις πρωτεΐνες H2B, HLA-A και HMGA1 ήταν 1kx552, 1kj349 και 2eze55, αντίστοιχα.
Η IFNα προκαλεί ένα δίκτυο αλληλεπίδρασης HLA-A με H2B (H2BFS), MDN1 και LRCH4.(Α) Ενδομοριακές (κόκκινες) και διαμοριακές (μπλε) διασταυρώσεις που παρουσιάζονται σε έναν 2D διαδραστικό χάρτη (που δημιουργείται σε λογισμικό SIM-XL) με το MDN1 να αναπαρίσταται ως κύκλος.Το όριο διασύνδεσης ορίστηκε στο 3,5.Τομείς διαφορετικών ταυτοτήτων έχουν χρωματική κωδικοποίηση32: H2B (ιστόνη; 2–102), MHC-I (MHC_1; 25–203, ομάδα C1; 210–290 και MHC_I_C; 337–364) και LRCH4 (LRR_8 (68–126), LRR_8 (137–194) και CH (535–641)).(Β) Σχέσεις μεταξύ πρωτεϊνών που εμφανίζονται στις δομές των πρωτεϊνών H2B, HLA-A, LRCH4 και MDN1 στο πρόγραμμα PyMOL.Αυτές οι δομές μοντελοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας τον διακομιστή Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) με δομές προτύπου 1kx552, 1kj349, 6hlu62 και 6i2665 για τις πρωτεΐνες H2B, HLA-A, LRCH4 και MDN1, αντίστοιχα.Διαγράμματα κουκκίδων που δείχνουν θέσεις αλληλεπίδρασης K ή S για HLA-A με H2B (C), LRCH4 (D) και MDN1 (E).Για τα οικόπεδα, το όριο βαθμολογίας διασύνδεσης ορίστηκε στο 3,0.
Εκτός από τη διατήρηση της ακεραιότητας του γονιδιώματος, η ιστόνη H2B εμπλέκεται επίσης στη ρύθμιση της μεταγραφής.Η πρωτεΐνη H2B αποτελείται από μια κεντρική περιοχή ιστόνης (HFD) που σχηματίζεται από τρεις α-έλικες που χωρίζονται από βρόχους και μια C-τελική ουρά 41,52.Το μεγαλύτερο μέρος της αλληλεπίδρασης με το H2B συμβαίνει στην α1 έλικα, η οποία παρέχει τριμερισμό με το ετεροδιμερές HFD (Εικ. 5Α, Β).Αν και οι λυσίνες εμπλέκονται στη σύνδεση του DNA, ορισμένες λυσίνες είναι επίσης εναλλακτικές θέσεις ακετυλίωσης ή μεθυλίωσης.Για παράδειγμα, τα υπολείμματα Κ43, Κ46 και Κ57 από το H2B δεν εμπλέκονται στην άμεση δέσμευση του DNA, αλλά είναι στόχοι διαφόρων μετα-μεταγραφικών τροποποιήσεων53.Ομοίως, τα υπολείμματα Κ44, Κ47 και Κ57 στο Η2Β μπορεί να παίζουν εναλλακτικό ρόλο παρουσία IFNα, συμπεριλαμβανομένων των αλληλεπιδράσεων με άλλες πρωτεΐνες (Εικ. 5Α, Β).Επιπλέον, η εξωχρωμοσωμική ιστόνη H2B ενεργοποιεί την ανοσολογική απόκριση σε διάφορους τύπους κυττάρων, ενεργώντας ως κυτοσολικός αισθητήρας για την ανίχνευση θραυσμάτων δίκλωνου DNA (dsDNA) που προέρχονται από μολυσματικούς παράγοντες ή κατεστραμμένα κύτταρα54.Παρουσία ιών DNA, η εξάντληση του H2B ανέστειλε την παραγωγή IFN-β και τη φωσφορυλίωση STAT154.Το H2B είναι επίσης γνωστό ότι κινείται μέσα και έξω από τον πυρήνα πιο γρήγορα από άλλες ιστόνες του πυρήνα54.Αλληλεπιδράσεις H2B με MDN1 και LRCH4 παρατηρήθηκαν επίσης σε επιλεγμένα δείγματα χωρίς επεξεργασία.Βρήκαμε ότι το HLA-A αλληλεπιδρά με το H2B και στα τρία δείγματα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με IFNα και σε ένα επαναλαμβανόμενο δείγμα χωρίς επεξεργασία.Αυτά τα δεδομένα αντικατοπτρίζουν το ρόλο του H2B σε μια εναλλακτική φυσιολογική λειτουργία ανεξάρτητη από τη μεταγραφική ρύθμιση.
Η HMGA1 (ομάδα υψηλής κινητικότητας AT-Hook 1), μια μικρή νουκλεοπρωτεΐνη πλούσια σε αμινοξέα που προάγουν την ασθένεια, έχει ταυτοποιηθεί σε σχέση με το HLA-A.Έχει μια όξινη C-τερματική ουρά και τρία διακριτά DBD που ονομάζονται AT hooks επειδή συνδέονται με τη δευτερεύουσα αυλάκωση της πλούσιας σε AT περιοχής στο dsDNA55,56.Αυτή η δέσμευση αναγκάζει το DNA να λυγίσει ή να ισιώσει, επιτρέποντας στους κανονικούς παράγοντες μεταγραφής να έχουν πρόσβαση στη συναινετική αλληλουχία του.Η καρβοξυτελική ουρά πιστεύεται ότι εμπλέκεται στις αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης και στη στρατολόγηση μεταγραφικών παραγόντων, δεδομένου ότι τα μεταλλάγματα διαγραφής του Οτελικού άκρου δεν είναι σε θέση να ξεκινήσουν τη μεταγραφή57.Επιπλέον, αυτή η περιοχή περιέχει αρκετές συντηρημένες θέσεις φωσφορυλίωσης που είναι γνωστά υποστρώματα για κινάσες 58.Παρατηρήσαμε αλληλεπιδράσεις HLA-A και H2B με το HMGA1 εκτός της C-τερματικής περιοχής, υποδηλώνοντας ότι η C-τερματική περιοχή χρησιμοποιείται κυρίως για τη δέσμευση του μεταγραφικού παράγοντα (Εικ. 5A, C).Οι πρωτεΐνες HMGA ανταγωνίζονται την ιστόνη Η1 για τη σύνδεση με το DNA του προσαρμογέα, αυξάνοντας έτσι την προσβασιμότητα57.Ομοίως, φαίνεται πιθανό ότι το HMGA αλληλεπιδρά με την ιστόνη H2B κατά μήκος του συνδετικού DNA σε ανταγωνισμό με την ιστόνη Η1.Το HMGB1 επάγει την έκφραση των HLA-A, -B και -C σε δενδριτικά κύτταρα, οδηγώντας στην ενεργοποίησή τους59, αλλά δεν έχει αναφερθεί προηγουμένως αλληλεπίδραση μεταξύ HMG και HLA.Βρήκαμε ότι το HMGA1 αλληλεπιδρά με τους τομείς α1 και α3 του HLA-A, με τις περισσότερες από τις αλληλεπιδράσεις εκτός του 3 DBD του (Εικόνα 5A,C).Στα χέρια μας, το HLA-A βρέθηκε να εντοπίζεται στον πυρήνα (τα δεδομένα δεν φαίνονται) και δεδομένου ότι τα H2B και HMGA1 υπάρχουν επίσης στον πυρήνα, αυτή η αλληλεπίδραση πιθανότατα συμβαίνει στον πυρήνα.Ειδικά προϊόντα προσθήκης που μετρήθηκαν μεταξύ H2B, HLA-A και HMGA1 φαίνονται στο Σχήμα 5D.
Οι περισσότερες αλληλεπιδράσεις του HLA-A με άλλες πρωτεΐνες συμβαίνουν εντός των περιοχών α1 και α2 και της διαταραγμένης C-τερματικής περιοχής (Εικ. 6).Σε ένα από αυτά τα παραδείγματα, βρήκαμε ότι το HLA-A αλληλεπιδρά με την διαταραγμένη Ν-τελική ουρά του LRCH4 (Εικόνα 6Α, Δ).Το LRCH4 ρυθμίζει την ενεργοποίηση του TLR4 και την επαγωγή κυτοκίνης LPS, ρυθμίζοντας έτσι την έμφυτη ανοσοαπόκριση60,61.Είναι μια πρωτεΐνη μεμβράνης με εννέα πλούσιες σε λευκίνη επαναλήψεις (LRRs) και ένα μοτίβο ομολογίας καλμοδουλίνης (CH) στον εκτοτομέα της, ακολουθούμενη από μια διαμεμβρανική περιοχή (TMD) 60, 62.Οι τομείς CH έχει αναφερθεί ότι μεσολαβούν στις αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης 60 .Ένα τμήμα περίπου 300 αμινοξέων μεταξύ των περιοχών LRR και CH είναι σχετικά προσβάσιμο αλλά διαταραγμένο.Με βάση τη λειτουργία των διαταραγμένων περιοχών ως μεσολαβητών των δικτύων πρωτεΐνης-πρωτεΐνης και της φυσαλιδώδους μεταφοράς 63, βρήκαμε ότι οι περισσότερες αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών συμβαίνουν σε διαταραγμένες περιοχές.Οι αλληλεπιδράσεις με το MDN1 κατανεμήθηκαν σε όλο το μήκος της πρωτεΐνης, συμπεριλαμβανομένων των περιοχών LRR1, LRR6, CH και τυχαίων περιοχών, ενώ το H2B δεσμεύτηκε κυρίως στην περιοχή CH (Εικ. 6Α, Β).Συγκεκριμένα, καμία από τις αλληλεπιδράσεις δεν περιελάμβανε το TMJ, υποδηλώνοντας την ειδικότητα της προσέγγισης CLMS (Εικόνα 6Α, Β).
Το MDN1 έχει επίσης αναγνωριστεί ως μέρος του δικτύου πρωτεΐνης HLA-A (Εικόνα 6Α).Ανήκει στην οικογένεια πρωτεϊνών ΑΑΑ (ATPases που σχετίζονται με διαφορετικές δραστηριότητες).Αυτή είναι η ίδια Ν-τερματική περιοχή ΑΑΑ που οργανώνεται σε έναν εξαμερικό δακτύλιο και αφαιρεί τον παράγοντα συναρμολόγησης από τη ριβοσωμική υπομονάδα 60S 64.φαίνεται να είναι παρόμοιο με το dynein64,65,66.Επιπλέον, η πλούσια σε Asp/Glu περιοχή ακολουθείται από την περιοχή MIDAS (θέση εξαρτώμενη από ιόντα μετάλλου).Λόγω του μεγάλου μεγέθους του MDN1 (περίπου 5600 αμινοξέα) και της περιορισμένης ομολογίας του με καλά μελετημένες πρωτεΐνες, λίγα είναι γνωστά για τη δομή και τη λειτουργία του στους ανθρώπους.Ταυτοποιήσαμε τα HLA-A, H2B και LRCH4 ως συνεργάτες δέσμευσης MDN1 και αποκαλύψαμε τον προσανατολισμό τους ως σύμπλοκα πρωτεΐνης στο PyMol (Εικ. 6Α, Β).Αυτές οι τρεις πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν με την περιοχή ΑΑΑ, την περιοχή σύνδεσης παρόμοια με dynein και πιθανώς την περιοχή MIDAS MDN1.Σε μια προηγούμενη αναφορά, ο καθαρισμός συγγένειας των πρωτεϊνών δολώματος αναγνώρισε το MDN1 ως πρωτεΐνη που σχετίζεται με την ιστόνη H2B67.Επιπλέον, μια πρόσφατη μελέτη ανέφερε επίσης μια αλληλεπίδραση μεταξύ MDN και HLA-B σε κύτταρα HCT116 χρησιμοποιώντας φασματομετρία μάζας καθαρισμένης με συγγένεια, υποστηρίζοντας τα ευρήματά μας68.Η αναγνώριση αυτού του συμπλόκου σε δείγματα που έχουν υποστεί αγωγή με IFNα υποδηλώνει ένα ρόλο για το MDN1 στη σηματοδότηση της ιντερφερόνης.
Επειδή τα γονίδια HLA είναι εξαιρετικά πολυμορφικά, εξάγαμε αναγνώσεις αλληλουχίας χαρτογράφησης HLA-A, -B και -C από δεδομένα αλληλουχίας RNA των κυττάρων Flo-1 (τα δεδομένα δεν εμφανίζονται).Οι αλληλουχίες πεπτιδίων που συνάδουν με την ανάγνωση αλληλουχίας αποκάλυψαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των HLA-A, -B, και -C σε περιοχές όπου τα πεπτίδια με σταυροδεσμούς βρίσκονταν στο HLA-A (Εικόνα S3).Επιπλέον, δεν παρατηρήσαμε διασύνδεση πρωτεΐνης προς πρωτεΐνη των μορίων HLA-B/C με πρωτεΐνες H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4.Αυτό υποδηλώνει ότι η αλληλεπίδραση πρωτεΐνης που βρέθηκε μεταξύ των HLA-A, MDN1, LRCH1 και HMGA1 είναι ειδική για το HLA-A.Επιπλέον, η πρωτεομική ανάλυση δειγμάτων χωρίς σταυροδεσμούς (Πίνακας S4) έδειξε ότι το HLA-A έχει υψηλότερη κάλυψη αλληλουχίας σε σύγκριση με το HLA-B ή το HLA-C.Τα πεπτίδια που ταυτοποιήθηκαν για το HLA-A ήταν υψηλής έντασης τόσο στα επεξεργασμένα με ΙΡΝα όσο και στα μη επεξεργασμένα δείγματα.
Για να διασφαλίσουμε ότι οι αλληλεπιδράσεις που εντοπίστηκαν εδώ δεν οφείλονταν σε μη ειδική διασύνδεση δύο πρωτεϊνών σε κοντινή χωρική εγγύτητα, επιβεβαιώσαμε περαιτέρω δύο νέους παράγοντες αλληλεπίδρασης HLA-A πραγματοποιώντας προσδιορισμούς συν-ανοσοκαθίζησης.Αλληλεπιδράσεις HLA-A με ενδογενή MDN1 και H2B ανιχνεύθηκαν τόσο σε κύτταρα Flo-1 που έχουν υποστεί αγωγή με IFNα όσο και σε μη επεξεργασμένα κύτταρα (Εικόνα 7, Εικόνα S4).Επιβεβαιώσαμε ότι το HLA-A δεσμεύτηκε από το H2B στα ανοσοκατακρημνίσματα και ότι αυτή η συσχέτιση οφειλόταν σε θεραπεία με IFNa αφού το HLA-A απουσίαζε στα δείγματα ανοσοκατακρημνίσματος από μη επεξεργασμένα κύτταρα (Εικόνα 7Α).Ωστόσο, τα δεδομένα μας υποδηλώνουν ότι η IFNα ρυθμίζει διαφορικά τη σύνδεση HLA-A με H2B και MDN1.Η IFNα προκαλεί συσχέτιση μεταξύ H2B και HLA-A, αλλά μειώνει τη συσχέτισή της με το MDN1.Βρήκαμε ότι το MDN1 συσχετίστηκε με το HLA-A σε μάρτυρες και η προσθήκη IFNa μείωσε αυτή την αλληλεπίδραση ανεξάρτητα από την επαγωγή MDN1 από την IFNa (Εικόνα 7B,C).Επιπλέον, η ανοσοκατακρήμνιση HLA-A κατέλαβε το H2B σε κύτταρα A549 (Εικ. S4), υποδηλώνοντας ότι αυτή η αλληλεπίδραση είναι ανεξάρτητη από τον κυτταρικό τύπο.Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν αλληλεπιδράσεις του HLA-A με τη μεσολάβηση ιντερφερόνης με H2B και MDN1.
Το HLA-A συν-καθαρίζει το H2B και το MDN1.Αντιπροσωπευτικά ενδογενή H2B (A) και MDN1 (B) ανοσοκηλίδες ανοσοκατακρημνίσθηκαν από κύτταρα Flo-1 που υπέστησαν αγωγή με IFNα και διερευνήθηκαν για τα υποδεικνυόμενα αντισώματα.Η IgG ποντικού και κουνελιού χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος.(Γ) Σχετικές ποσότητες (εισαγωγή) διαφορετικών αντιγόνων απεικονίζονται με ανοσοκηλίδες που ανιχνεύονται έναντι των υποδεικνυόμενων αντισωμάτων, η β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.
Οι δομικές ιδιότητες ενός από τα επαγόμενα από ιντερφερόνη εξαιρετικά αξιόπιστα διασυνδεδεμένα δίκτυα, H2B-HLA-A-HMGA1, διερευνήθηκαν.Χρησιμοποιήσαμε μοντελοποίηση μοριακής δυναμικής ως εναλλακτική προσέγγιση για να κατανοήσουμε τη δυναμική διαμόρφωσης των πρωτεϊνών που εμπλέκονται σε αυτό το σύμπλεγμα (Εικόνα 8).Συμπεράσματα από τα δεδομένα CLMS υποδηλώνουν την πιθανότητα διαφορετικών διαμορφώσεων των πρωτεϊνών H2B, HLA-A και HMGA1.Επομένως, τα ακόλουθα πιθανά σύμπλοκα μοντελοποιήθηκαν σε ένα διαλυτικό μέσο: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A και H2B-HLA-A-HMGA1.Μια αρχική οθόνη σύνδεσης πρωτεΐνης-πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας το πακέτο MOE (Molecular Operating Environment; Chemical Computing Group Inc., Μόντρεαλ, Κεμπέκ, Καναδάς) πρότεινε πιθανές διαμορφώσεις που διαφέρουν μεταξύ αυτών των πρωτεϊνών (Εικ. 8Α).Η οπτικοποίηση του συμπλόκου πρωτεΐνης σύνδεσης αποκάλυψε αρκετές αλληλεπιδράσεις και πιθανές διαμορφώσεις (Εικόνα 5Α, 8).Έτσι, μια πιθανή διαμόρφωση παρουσιάζεται στο Σχήμα 8Α (με επισημασμένες διασταυρώσεις) και αξιολογήθηκε περαιτέρω χρησιμοποιώντας τη γραμμή μοντελοποίησης MD.Επιπλέον, η δέσμευση του H2B ή του HMGA1 στο HLA-A υπογραμμίζει την υψηλότερη συγγένεια του H2B για το HLA-A (Εικ. 8Α).
Δυναμική διαμόρφωσης πιθανών δικτύων μεταξύ των συμπλεγμάτων H2B (H2BFS)-HLA-A, HMGA1-HLA-A και H2B-HLA-A-HMGA1.(Α) Το αριστερό πλαίσιο είναι ένας δισδιάστατος χάρτης (που δημιουργείται σε λογισμικό SIM-XL) ενδομοριακών (κόκκινων) και διαμοριακών (μπλε) σταυροδεσμών (διακοπή διασταύρωσης σε 3,5).Επιπλέον, τα υπολείμματα διασύνδεσης που ταυτοποιούνται επισημαίνονται στις δομές των πρωτεϊνών H2B, HLA-A και HMGA1.Οι σχετικές διαμορφώσεις αυτών των πρωτεϊνών εξήχθησαν χρησιμοποιώντας τον αγωγό σύνδεσης που εφαρμόστηκε στο πακέτο MOE.Το κάτω αριστερό πλαίσιο δείχνει τις διάφορες πιθανές διαμορφώσεις των συμπλόκων H2B-HLA-A και HMGA1-HLA-A με διαφορετικές συγγένειες δέσμευσης πρωτεΐνης-πρωτεΐνης (GBVI/WSA dG, kcal/mol).(Β) Τυπική απόκλιση (RMSD) των ατομικών θέσεων (εξαιρουμένων των ατόμων υδρογόνου) για κάθε δομή πρωτεΐνης.(Γ) Διαμοριακές αλληλεπιδράσεις δεσμού υδρογόνου πρωτεΐνης-πρωτεΐνης από διάφορα προσομοιωμένα σύμπλοκα λαμβάνοντας υπόψη ειδικές αλληλεπιδράσεις διάρκειας ≥ 10 ns.Η απόσταση αποκοπής δότη-δέκτη δεσμού h ορίστηκε σε 3,5 Α και η γωνία αποκοπής δότη-δέκτη H ορίστηκε σε ≥ 160°–180°.(D) Επισημασμένα υπολείμματα που σχηματίζουν αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης HLA-A με τους αντίστοιχους συνεργάτες τους, που εκτείνονται σε ≥ 20 ns, εξαγόμενα από εικονικά σύμπλοκα HLA-A-H2B και HLA-A-HMGA1.Οι πρωτεϊνικές δομές αντιπροσωπεύουν μια μέση δομή 100 ns MDS.(Ε) Αλληλεπιδράσεις μεταξύ συμπλόκων HLA-A-H2B και HLA-A-HMGA1 σε σύγκριση με αλληλεπιδράσεις που παρακολουθούνται με προσομοίωση H2B-HLA σε διάστημα 100 ns με βάση τη θέση αλληλεπίδρασης K ή S μεταξύ των δύο πεπτιδίων.Συμπλέγματα /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.Η τιμή κατωφλίου για την αξιολόγηση των διασταυρούμενων συνδέσεων ορίστηκε στο 3,0 και ελήφθησαν υπόψη συγκεκριμένες αλληλεπιδράσεις από MDS που λαμβάνουν ≥ 10 ns.Οι πρωτεϊνικές δομές οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας πακέτα BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, USA) και Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Μόντρεαλ, Κεμπέκ, Καναδάς).
Η σταθερότητα των μορίων HLA-A με την πάροδο του χρόνου (τυπική απόκλιση, RMSD ή τυπική απόκλιση, RMSF) έδειξε ότι η παρουσία πρωτεϊνών H2B ή HMGA1 στα σύμπλοκα σταθεροποίησε το HLA-A (Εικόνα 8Β, Εικόνα S5).Η πρωτεΐνη HMGA1 συνδέεται στενά με τη θέση B2M του HLA-A, επάγοντας τη σταθερότητα των αμινοξέων HLA-A στο σύμπλεγμα HLA-A-HMGA1 ή H2B-HLA-A-HMGA1 (Εικόνα 8Β, Εικόνα S5).Συγκεκριμένα, τα υπολείμματα HLA ~60-90 και ~180-210 βρέθηκαν να είναι λιγότερο εύκαμπτα παρουσία Η2Β (ΣΧΗΜΑ 8Β).Τα H2B και HMGA1 έδειξαν καλύτερη σύνδεση με HLA-A στο σύμπλεγμα H2B-HLA-A-HMGA1 σε σύγκριση με τη δέσμευση HLA-A με H2B ή HMGA1 μόνο (Εικόνα 8C,D, Πίνακας S5).Τα υπολείμματα που εμπλέκονται σε δεσμούς υδρογόνου (υψηλή πληρότητα βάσει μοντέλου MD ≥ 10 ns) συμπίπτουν με τις θέσεις αλληλεπίδρασης CLMS (υπολείμματα K ή S) στο σύμπλεγμα, υποδηλώνοντας ότι οι αλληλεπιδράσεις που προσδιορίζονται από το CLMS είναι πολύ αξιόπιστες.Αξιοπιστία (Εικ. 8Ε ).Στη μοντελοποίηση CLMS και MD, υπολείμματα HLA-A μεταξύ περίπου 190-210 και περίπου 200-220 αμινοξέων βρέθηκαν να δεσμεύουν H2B και HMGA1, αντίστοιχα (ΣΧΗΜΑ 8Ε).
Οι αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης σχηματίζουν δυναμικά δομικά δίκτυα που μεσολαβούν στην ενδοκυτταρική επικοινωνία ως απόκριση σε ορισμένα ερεθίσματα.Επειδή πολλές προσεγγίσεις πρωτεϊνικής ανιχνεύουν αλλαγές στο συνολικό επίπεδο σταθερής κατάστασης μιας πρωτεΐνης, η δυναμική αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης-πρωτεΐνης απαιτεί πρόσθετα εργαλεία για τη σύλληψη διεπαφών σύνδεσης και το CLMS είναι ένα τέτοιο εργαλείο.Το σύστημα σηματοδότησης ιντερφερόνης είναι ένα δίκτυο κυτοκινών που επιτρέπει στα κύτταρα να ανταποκρίνονται σε μια σειρά περιβαλλοντικών παθογόνων και εγγενών παθολογικών σημάτων, με αποκορύφωμα την επαγωγή υποομάδων πρωτεϊνών που επάγονται από ιντερφερόνη.Εφαρμόσαμε CLMS για να προσδιορίσουμε εάν θα μπορούσαν να εντοπιστούν νέες αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης μεταξύ μιας ομάδας πρωτεϊνών που προκαλούνται από ιντερφερόνη.Παγκόσμια ανάλυση διασύνδεσης πρωτεϊνών σε ένα μοντέλο κυττάρων Flo-1 που ανταποκρίνεται στην ιντερφερόνη χρησιμοποιήθηκε για τη σύλληψη συμπλεγμάτων πρωτεΐνης.Η εκχύλιση τρυπτικών πεπτιδίων από μη διασυνδεδεμένα και διασυνδεδεμένα κύτταρα επιτρέπει μέτρηση πεπτιδίων, εμπλουτισμό οδού και κατανομή μήκους πεπτιδίου με καθορισμένη ένταση LFQ.Οι κανονικές επαγώγιμες από ιντερφερόνη πρωτεΐνες ταυτοποιήθηκαν ως θετικός εσωτερικός μάρτυρας, ενώ παρατηρήθηκαν νέα διαμοριακά και ενδομοριακά διασυνδεδεμένα προϊόντα προσθήκης κανονικών επαγώγιμων από ιντερφερόνη πρωτεϊνών όπως MX1, UP18, OAS3 και STAT1.Έχουν διερευνηθεί διάφορα δομικά χαρακτηριστικά και αλληλεπιδράσεις σε λειτουργικές περιοχές.
Μια αλληλεπίδραση μεταξύ HLA-A, MDN1 και H2B ανιχνεύθηκε με ανοσοστύπωση σε κύτταρα Flo-1 και A549 που υποβλήθηκαν σε αγωγή και χωρίς αγωγή με IFNα.Τα αποτελέσματά μας υπογραμμίζουν ότι το HLA-A συμπλέκεται με το H2B με τρόπο που εξαρτάται από την IFNα.Το έργο μας αντιπροσωπεύει μια ενδιαφέρουσα λεωφόρο για περαιτέρω διερεύνηση του συνεντοπισμού αυτών των δύο συγκροτημάτων.Θα ήταν επίσης ενδιαφέρον να επεκταθεί η προσέγγιση CLMS σε μια ομάδα κυτταρικών σειρών για τον εντοπισμό πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων που διαμεσολαβούνται από ιντερφερόνη ανεξάρτητες από κυτταρικό τύπο.Τέλος, χρησιμοποιήσαμε τη μοντελοποίηση MD ως εναλλακτική προσέγγιση για να κατανοήσουμε τη δομική δυναμική των πρωτεϊνών που εμπλέκονται στο σύμπλεγμα H2BFS-HLA-A-HMGA1, το οποίο παρακολουθούσε ενδομοριακές και διαμοριακές διασταυρώσεις.Συμπεράσματα από τα δεδομένα CLMS υποδηλώνουν την πιθανότητα διαφορετικών διαμορφώσεων των πρωτεϊνών H2BFS, HLA-A και HMGA1.Οι πιθανές διαφορετικές διαμορφώσεις μεταξύ αυτών των συμπλεγμάτων πρωτεΐνης σύνδεσης αποκάλυψαν αρκετές αλληλεπιδράσεις παρόμοιες με αυτές που παρατηρήθηκαν στο σύνολο δεδομένων CLMS.Ένα από τα κύρια πλεονεκτήματα της μεθόδου μας είναι ότι επιτρέπει την εύκολη αναγνώριση αλληλεπιδρώντων υψηλά πολυμορφικών γονιδίων όπως το HLA, επομένως θα είναι ενδιαφέρον να μελετήσουμε αλληλεπιδράσεις ειδικών για απλότυπο HLA πρωτεϊνών που κατά τα άλλα είναι δύσκολο να μελετηθούν.Συνολικά, τα δεδομένα μας αποδεικνύουν ότι το CLMS μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να επεκτείνουμε την κατανόησή μας για τα επαγόμενα από την ιντερφερόνη δίκτυα σηματοδότησης και να παρέχει μια βάση για τη μελέτη πιο περίπλοκων μεσοκυττάριων συστημάτων στο μικροπεριβάλλον του όγκου.
Τα κύτταρα Flo-1 ελήφθησαν από ATCC και διατηρήθηκαν σε DMEM (Gibco) συμπληρωμένο με 1% πενικιλλίνη/στρεπτομυκίνη (Invitrogen), 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (Gibco) και αποθηκεύτηκαν στους 37°C και 5% CO2.Επώαση.Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε συρροή 70-80% προτού υποβληθούν σε επεξεργασία με IFNa14 (κατασκευασμένη από Edinburgh Protein Production Facility).Όλα τα άλλα χημικά και αντιδραστήρια αγοράστηκαν από τη Sigma Aldrich εκτός εάν αναφέρεται διαφορετικά.
Τα κύτταρα Flo-1 καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία 6 φρεατίων και την επόμενη ημέρα τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 ng/ml IFNa14 για 24 ώρες σε συρροή περίπου 80%.Τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές με PBS και απολινώθηκαν με πρόσφατα παρασκευασμένο DSS (Thermo Fisher Scientific) (διαλυμένο σε DMSO) σε PBS για 5 λεπτά στους 37°C σε τελική συγκέντρωση 0,5 mM.Η αντίδραση διασύνδεσης DSS αντικαταστάθηκε με PBS και το απομένον DSS σβήστηκε με προσθήκη 20 mM Tris (ρΗ 8,0) σε PBS για 15 λεπτά στους 37°C.Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με απόξεση και συλλέχθηκαν σε σωλήνες χαμηλής δέσμευσης (Axygen).
Το κυτταρικό ίζημα λύθηκε με 300 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος λύσης ουρίας (8 Μ ουρία, 0,1 Μ Tris, ρΗ 8,5) για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου με περιστασιακή ανακίνηση.Όλα τα στάδια φυγοκέντρησης πραγματοποιήθηκαν στα 14.000 xg στους 8°C.Φυγοκεντρήστε το προϊόν λύσης για 10 λεπτά και μεταφέρετε το υπερκείμενο σε νέο σωληνάριο.Τα υπόλοιπα διαυγή σωματίδια διαλύθηκαν σε 150 μl του δεύτερου ρυθμιστικού διαλύματος λύσης (2 Μ ουρία, 2% (β/ο) SDS (δωδεκυλοθειικό νάτριο)) για 30 λεπτά ή περισσότερο μέχρι να ληφθεί ένα ομοιογενές υδατικό διάλυμα.Το προϊόν λύσης φυγοκεντρήθηκε για 20 λεπτά και το υπερκείμενο αναμίχθηκε με το προϊόν λύσης που ελήφθη στο προηγούμενο στάδιο.Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης εκτιμήθηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία Micro BCA (Thermo Fisher Scientific) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή για διαδικασίες μικροπλακών.Τα δείγματα καταψύχθηκαν γρήγορα σε υγρό άζωτο και αποθηκεύτηκαν στους -80°C.
Περίπου 100 μg διαλυτής διασυνδεδεμένης πρωτεΐνης υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας ένα τροποποιημένο πρωτόκολλο προετοιμασίας δείγματος διήθησης (FASP) όπως περιγράφεται από τους Wisniewski et al.69 Εν συντομία, η πρωτεΐνη διασυνδέεται με 200 μl ρυθμιστικού διαλύματος ουρίας (8 Μ ουρίας σε 0,1 Μ Tris, ρΗ 8,5), στροβιλίζεται και μειώνεται στο μισό.Όλα τα στάδια φυγοκέντρησης πραγματοποιήθηκαν στα 14.000 xg στους 25°C.Το πρώτο μισό του διασυνδεδεμένου προϊόντος λύσης πρωτεΐνης μεταφέρθηκε σε μια συσκευή φυγόκεντρου φίλτρου Microcon 10 kDa εξοπλισμένη με μεμβράνη Ultracel-10 (Merck), ακολουθούμενη από φυγοκέντρηση στο φίλτρο για 25 λεπτά.Στη συνέχεια, προσθέστε το δεύτερο μισό της πρωτεΐνης στο φίλτρο και επαναλάβετε τα ίδια βήματα.Η ανάκτηση πρωτεΐνης πραγματοποιήθηκε με την προσθήκη 100 μl υδροχλωρικής τρις(2-καρβοξυαιθυλ)φωσφίνης (TCEP) 17 mM σε ρυθμιστικό διάλυμα ουρίας.Η ανάκτηση αναδεύτηκε σε θερμομίκτη στις 600 rpm για 30 λεπτά στους 37°C.Επιπλέον, η στήλη φυγοκεντρήθηκε και η μειωμένη διασυνδεδεμένη πρωτεΐνη αλκυλιώθηκε χρησιμοποιώντας 100 μl ιωδοακεταμιδίου 50 mM σε ρυθμιστικό διάλυμα ουρίας.Η αντίδραση αλκυλίωσης διεξήχθη σε θερμοκρασία δωματίου για 20 λεπτά στο σκοτάδι.Περιστρέψτε τη στήλη, πλύνετε τα τοιχώματα της στήλης 3 φορές με 100 μl ρυθμιστικού διαλύματος ουρίας και στη συνέχεια φυγοκεντρήστε.Η ίδια επέμβαση πραγματοποιήθηκε 3 φορές χρησιμοποιώντας 100 μl διττανθρακικού αμμωνίου 100 mM.Πριν από την θρυψίνη, αντικαταστήστε το σωληνάριο συλλογής με νέο.Προσθέστε ρυθμιστικό διάλυμα πέψης που περιέχει 50 mM διττανθρακικό αμμώνιο και 1 μl θρυψίνης αραιωμένο σε ρυθμιστικό διάλυμα θρυψίνης (Promega).Η αναλογία θρυψίνης προς πρωτεΐνη διατηρήθηκε περίπου στο 1:33 και οι αντιδράσεις πέψης επωάστηκαν όλη τη νύχτα στους 37°C σε έναν υγρό θάλαμο.Το διασυνδεδεμένο πεπτίδιο εκλούστηκε από το φίλτρο με φυγοκέντρηση για 25 λεπτά.Η ανάκτηση πεπτιδίου βελτιώθηκε με την προσθήκη 50 μl NaCl 0,5 M στο φίλτρο, ακολουθούμενη από φυγοκέντρηση για 25 λεπτά.
Οι στήλες C18 Micro Spin (Harvard Apparatus) χρησιμοποιήθηκαν για την αφαλάτωση των διασυνδεδεμένων τρυπτικών πεπτιδίων ακολουθώντας το πρωτόκολλο που περιγράφεται από τους Bouchal et al.70 με μικρές τροποποιήσεις.Εν συντομία, οι στήλες περιδίνησης C18 ενεργοποιήθηκαν με τρεις πλύσεις 0,1% μυρμηκικού οξέος (FA) σε ακετονιτρίλιο (AcN) (Merck) και δύο πλύσεις 0,1% FA.Η στήλη ενυδατώθηκε με 0,1% FA για 15 λεπτά.Τοποθετήστε τα δείγματα σε στήλες περιδίνησης και πλύνετε 3 φορές με 0,1% FA.Τα αφαλατωμένα πεπτίδια εκλούστηκαν διαδοχικά με μια σταδιακή βαθμίδωση χρησιμοποιώντας 50%, 80% και 100% AcN σε 0,1% FA.Τα δείγματα ξηράνθηκαν σε συμπυκνωτή SpeedVac Plus (Eppendorf) έως ότου εξαφανιστεί τελείως το υπολειμματικό υγρό.Τα εκλουόμενα πεπτίδια διαλύθηκαν σε 100 μl τριφθοροξικού οξέος 0,08% σε 2,5% AcN και οι συγκεντρώσεις μετρήθηκαν σε NanoDrop 2000 (Thermo Scientific).Περίπου 1 μg διασυνδεδεμένου πεπτιδίου ανά δείγμα εγχύθηκε στο σύστημα LC-MS/MS.
Τα διασυνδεδεμένα πεπτίδια διαχωρίστηκαν σε σύστημα UltiMate 3000 RSLCnano LC (Thermo Scientific) συνδεδεμένο με φασματόμετρο μάζας Orbitrap Exploris 480 (Thermo Scientific).Τα διασυνδεδεμένα πεπτίδια συλλέχθηκαν σε μια στήλη σύλληψης 300 μm ID, μήκους 5 mm μ-προ-στήλης C18 γεμάτη με ροφητή C18 PepMap100 και ροφητή 5 μm PepMap (Thermo Scientific).Φορτώστε τη ρύθμιση ροής της αντλίας στα 5 μl/min 0,08% τριφθοροξικό οξύ διαλυμένο σε 2,5% AcN.Τα διασυνδεδεμένα πεπτίδια διαχωρίστηκαν σε μια αναλυτική στήλη συντηγμένου πυριτίου με εσωτερική διάμετρο 75 μm και μήκος 150 mm, γεμάτη με ροφητή PepMap 2 μm (Thermo Scientific).Οι κινητές φάσεις Α και Β αποτελούνταν από 0,1% FA σε νερό και 0,1% FA σε ακετονιτρίλιο, αντίστοιχα.Η κλίση ξεκινά από το 2,5% B και αυξάνεται γραμμικά στο 40% B για 90 λεπτά, στη συνέχεια στο 90% B για τα επόμενα 2 λεπτά.Η σύνθεση κινητής φάσης διατηρήθηκε στο 90% Β για 10 λεπτά και στη συνέχεια μειώθηκε γραμμικά στο 2,5% Β για 2 λεπτά.Η στήλη εξισορροπήθηκε στο 2,5% Β για 8 λεπτά πριν από τον επόμενο κύκλο.Τα διασυνδεδεμένα πεπτίδια που εκλούστηκαν από την αναλυτική στήλη ιονίστηκαν σε μια πηγή ιονισμού νανοηλεκτροψεκασμού (NSI) και εγχύθηκαν σε ένα φασματόμετρο μάζας Exploris 480 (Thermo Scientific).
Το φασματόμετρο μάζας Orbitrap Exploris 480 λειτουργούσε στη λειτουργία θετικής συσχέτισης δεδομένων.Πραγματοποιήθηκε πλήρης σάρωση σε λειτουργία τομής σε ανάλυση 120.000 με ρυθμίσεις εύρους από m/z 350 Th έως m/z 2000 Th.Ο κανονικοποιημένος στόχος AGC ορίστηκε στο 300% με μέγιστο χρόνο εισαγωγής 50 ms.Η μονοϊσοτοπική ανίχνευση κορυφής έχει καθιερωθεί για πεπτίδια.Η παράμετρος χαλάρωσης περιορισμών ορίζεται σε αληθές εάν βρεθούν πολύ λίγοι πρόδρομοι.Η ελάχιστη ιοντική ισχύς του προδρόμου ορίστηκε σε 5,0e3 και οι καταστάσεις φορτίου πρόδρομου έως +8 συμπεριλήφθηκαν στα πειράματα.
Ο χρόνος κύκλου μεταξύ των μεγάλων σαρώσεων στη λειτουργία συσχέτισης δεδομένων ορίστηκε στα 2,5 δευτερόλεπτα.Ο αποκλεισμός δυναμικής μάζας ορίστηκε στα 20 δευτερόλεπτα μετά τον πρώτο κατακερματισμό του πρόδρομου ιόντος.Το παράθυρο απομόνωσης πρόδρομου ορίστηκε σε 2 Th.Ο τύπος της κανονικοποιημένης ενέργειας σύγκρουσης με μια σταθερή λειτουργία ενέργειας σύγκρουσης επιλέχθηκε σε μια σάρωση MS/MS που εξαρτάται από τα δεδομένα.Η ενέργεια σύγκρουσης ορίστηκε στο 30%.Η ανάλυση Orbitrap ορίστηκε σε 15.000 και ο στόχος AGC στο 100%.Ο προσαρμοσμένος μέγιστος χρόνος έγχυσης έχει οριστεί στα 60 χιλιοστά του δευτερολέπτου.
Πριν από την παρακολούθηση του δικτύου πρωτεΐνης-πρωτεΐνης σε δείγματα με διασύνδεση, επεξεργαστήκαμε τα ακατέργαστα αρχεία χρησιμοποιώντας το πακέτο MaxQuant (έκδοση 1.6.12.0)26,27 για να αναγνωρίσουμε ανιχνεύσιμα πεπτίδια/πρωτεΐνες στα δείγματα.Επιπροσθέτως, παρόμοιες πρωτεομικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν σε δείγματα Flo-1 χωρίς διασταύρωση που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία και χωρίς επεξεργασία με IFNa.Τα δεδομένα MS/MS αναζητήθηκαν στην ανθρώπινη βάση δεδομένων UniProt (www.uniprot.org) (που ανέβηκε στις 12 Αυγούστου 2020, περιέχει 75.093 εγγραφές) χρησιμοποιώντας την ενσωματωμένη μηχανή αναζήτησης Andromeda27.Η αναζήτηση πραγματοποιήθηκε χωρίς να υποδειχθεί η ειδικότητα του ενζύμου και διάφορες τροποποιήσεις της αποαμίδωσης (Ν, Q) και της οξείδωσης (Μ).Οι ανοχές μάζας πρόδρομων ορίστηκαν στα 20 ppm και τα ιόντα προϊόντος στα 0,02 Da.Η αρχική και η μέγιστη απόκλιση μάζας ορίστηκαν στα 10 ppm.Η μέγιστη μάζα του πεπτιδίου ορίστηκε στα 4600 Da και η ομοιότητα αλληλουχίας ορίστηκε μεταξύ 7 και 25 αμινοξέων (aa).Πραγματοποιήθηκε περαιτέρω στατιστική ανάλυση χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα Perseus (έκδοση 1.6.10.45).Η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη υπολογίστηκε με κανονικοποίηση της φασματικής έντασης της πρωτεΐνης (ένταση LFQ, ποσοτικοποίηση χωρίς επισήμανση)27 και οι τιμές έντασης μετατράπηκαν σε Log2.Μια ιεραρχική ομαδοποίηση πρωτεϊνών που ταυτοποιήθηκαν από την ένταση του πεπτιδίου τους δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας το πακέτο pheatmap (v1.0.12) στο R (v 4.1.2).Η ανάλυση εμπλουτισμού οδού διεξήχθη χρησιμοποιώντας τη βάση δεδομένων μονοπατιού Reactome για πρωτεΐνες που υποβλήθηκαν σε αγωγή με IFNα που ενεργοποιήθηκαν περισσότερο από τέσσερις φορές σε σύγκριση με δείγματα που δεν υποβλήθηκαν σε θεραπεία.
Η ταυτοποίηση των ειδικών χημικών σταυροδεσμών λυσίνης (Κ) ή σερίνης (S) συμπλεγμάτων πρωτεϊνών που παρακολουθούνται με LC-MS/MS πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μια φασματοσκοπική μηχανή αναγνώρισης (SIM-XL) για πεπτίδια με σταυροδεσμούς (SIM-XL)29.Πρώτον, διερευνήθηκαν πιθανές αλληλεπιδράσεις μεταξύ γονιδίων υπογραφής αντοχής σε βλάβη του DNA (IRDS) που σχετίζονται με ιντερφερόνη (IFN) χρησιμοποιώντας το σύνολο δεδομένων πρωτεΐνης IRDS που περιγράφεται στους Padariya et al.28.Ο έλεγχος όλων των συνθηκών και των επαναλήψεων ολόκληρου του ανθρώπινου UniProt είναι υπολογιστικά εντατικός, επομένως ολόκληρη η βάση δεδομένων του ανθρώπινου UniProt (www.uniprot.org) (που λήφθηκε στις 12 Αυγούστου 2020, περιέχει 75.093 εγγραφές) έναντι επαναλήψεων που έχουν υποστεί αγωγή με IFNα.Ένα από τα φίλτρα για αλληλεπιδράσεις υψηλής εμπιστοσύνης.Αυτές οι αλληλεπιδράσεις υψηλής σημασίας που ελήφθησαν επεκτάθηκαν και δοκιμάστηκαν σε όλες τις επαναλήψεις και συνθήκες.
Στη SIM-XL, το DSS χρησιμοποιήθηκε για το crosslinker (XL) και η μετατόπιση βάρους XL και η μετατόπιση βάρους τροποποίησης ορίστηκαν σε 138,06 και 156,07, αντίστοιχα.Θεωρούνται οι ακόλουθες θέσεις αντίδρασης διασύνδεσης: KK, KS και KN-TERM, χωρίς ιόντα αναφοράς.Τόσο ο πρόδρομος όσο και το θραύσμα ppm ρυθμίστηκαν στο 20 και ο ουδός Xrea ορίστηκε στο 0,15.Η θρυψίνη θεωρήθηκε ότι είναι εντελώς ειδική και εφαρμόστηκε μια μέθοδος κατακερματισμού υψηλής ενέργειας C-trap (HCD).Ο ουδός μείωσης δυναμικής DB XCorr και ο ελάχιστος αριθμός πεπτιδίων για δυναμική μείωση DB ορίστηκαν σε 2,5 και 2, αντίστοιχα.Άλλες παράμετροι είναι: πιθανότητα μονοϊσοτόπου και αποκοπή σύμπτωσης αιχμής, ελάχιστα 4 υπολείμματα AA ανά κλώνο και μέγιστη φόρτιση κλώνου και 3 μέγιστα χαμένων διαχωρισμών.Οι προκύπτοντες ραμμένοι δισδιάστατοι χάρτες αναλύθηκαν σε (SIM-XL) και η γραφική αναπαράσταση xQuest28 χρησιμοποιήθηκε για την κατασκευή των 2D χαρτών.Οι σταυροδεσμοί πρωτεϊνών σε πρωτεϊνικές δομές παρέχονται στο PyMol (PyMOL Molecular Graphics System, έκδοση 2.0 Schrödinger, LLC).
Οι δομές πρωτεϊνικών μοντέλων δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας τον διακομιστή Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 χρησιμοποιώντας τις αρχές μοντελοποίησης ομολογίας και υλοποίησης της «Κρυμμένης μεθόδου Markov».Το Phyre2 δημιουργεί δομές μοντέλου που βασίζονται στην ευθυγράμμιση αλληλουχίας με γνωστές δομές πρωτεΐνης.Για πρωτεΐνες H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4 και MDN1, χρησιμοποιήθηκαν δομές μήτρας 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62 και 6i2665.Επιπλέον, ελήφθη υπόψη η δομή των AlphaFold71 MX1, UBP18 και ROBO1.Η δομή της πρωτεΐνης οπτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το πακέτο BIOVIA Discovery Studio Visualizer (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, CA, USA) και το πακέτο Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Μόντρεαλ, Κεμπέκ, Καναδάς).